Etablierung des stickstofffixierenden Alphaproteobakteriums Sinorhizobium meliloti als Chassis-Organismus in der Synthetischen Mikrobiologie

Die Synthetische Biologie benötigt Strategien, die effizientes Genetic Engineering erlauben. Eine grundlegende Voraussetzung hierzu ist die Etablierung von Techniken zur spezifischen DNA-Modifikation im Umfang einzelner Nukleotide bis hin zu ganzen Chromosomen. Während für Modellorganismen der Synth...

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Main Author: Döhlemann, Johannes
Contributors: Becker, Anke (Prof, Dr) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Die Synthetische Biologie benötigt Strategien, die effizientes Genetic Engineering erlauben. Eine grundlegende Voraussetzung hierzu ist die Etablierung von Techniken zur spezifischen DNA-Modifikation im Umfang einzelner Nukleotide bis hin zu ganzen Chromosomen. Während für Modellorganismen der Synthetischen Mikrobiologie ein großes Repertoire leistungsfähiger Werkzeuge zur Verfügung steht, war das Methodenspektrum zur genetischen Veränderung von Rhizobien aus der Klasse der Alphaproteobakterien lange Zeit eingeschränkt. In symbiotischen Lebensgemeinschaften mit Leguminosen besitzt Sinorhizobium meliloti die Fähigkeit, atmosphärischen Stickstoff zu biogenen Stickstoffverbindungen zu assimilieren, wodurch dem α-Rhizobium insbesondere landwirtschaftliche Relevanz zukommt. Aufgrund seiner besonderen Genomarchitektur, die neben einem Chromosom ein weiteres Chromid (pSymB) und Megaplasmid (pSymA) aufweist, ist S. meliloti außerdem ein Modellorganismus zur Erforschung mehrteiliger Genome in Bakterien. pSymA und pSymB, die ~45% der genomischen DNA tragen, besitzen repABC-basierte Replikationsursprünge, welche die Integration dieser extra-chromosomalen Replikons in den Zellzyklus vermitteln. Die repABC-Region wurde in dieser Arbeit als funktionelle Einheit identifiziert, die Chromosomen-ähnliche Eigenschaften wie eine stabile Vererbung und einfache Kopienzahl vermittelt. Auf Basis heterologer repABC-Kassetten verschiedener α-Rhizobien konnte außerdem ein Shuttle-Vektorsystem etabliert werden. Ein modulares und standardisiertes Assemblierungssystem ermöglichte hierbei die in-vitro Herstellung artifizieller Mini-Replikons. Diese können sowohl als klassische Klonierungsvektoren in E. coli, aber auch zur Etablierung mehrteiliger Expressionssysteme in S. meliloti eingesetzt werden. Eine neue Genome Editing-Methode sowie verbesserte Cre/lox-basierte Rekombinationsstrategien wurden entwickelt und erweitern das Repertoire genetischer Werkzeuge für S. meliloti. Ihre Anwendung konnte mittels Deletion und Inversion umfangreicher Genomabschnitte, sowie substantieller Genom-Umstrukturierungen demonstriert werden. Cre/lox-Anwendungen und eine Methode zur in-vivo Klonierung großer DNA-Fragmente ermöglichen neue experimentelle Ansätze, die bei der mechanistischen Aufklärung des mehrteiligen Genoms sowie in synthetischen Anwendungen von großem Nutzen sind. Die robuste Funktion des Cre/lox-Systems und die weite Verbreitung repABC-basierter Replikons innerhalb der α-Rhizobien bergen zudem das Potential, die in dieser Arbeit etablierten Methoden auf weitere Vertreter dieser landwirschaftlich und biotechnologisch relevanten Organismen zu übertragen.
Physical Description:171 pages.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2017.0142