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Rekombinante Produktion, Aufreinigung und Kristallisation der Shigella Pathogenitätsfaktoren Spa15, IpgC und OspD1
Viele gramnegative Bakterien, so auch Shigella flexneri, benutzen einen Typ-III Sekretionsapparat (T3SA), welcher der Sekretion bakterieller Proteine in eukaryotische Zellen dient. Diese Proteine ermöglichen es den Bakterien, die eukaryotischen Zellen zu infizieren. Etwa 20 strukturelle Proteine...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2016
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Viele gramnegative Bakterien, so auch Shigella flexneri, benutzen einen Typ-III
Sekretionsapparat (T3SA), welcher der Sekretion bakterieller Proteine in
eukaryotische Zellen dient. Diese Proteine ermöglichen es den Bakterien, die
eukaryotischen Zellen zu infizieren. Etwa 20 strukturelle Proteine sowie Chaperone aus dem mxi-spa-Operon sind nötig, um den T3SA zu bilden. Die sogenannten „frühen Gene“ des Shigella-Virulenzplasmids erhalten Informationen für die Synthese der strukturellen Proteine und Invasine. Sie werden von VirF reguliert. Die „später abgelesenen Gene“ des Plasmids stellen sicher, dass die Wirtszelle möglichst lange am Leben bleibt und werden vom Transkriptionsaktivator MxiE reguliert. Ihre Regulation auf Transkriptionsebene erfolgt durch die Aktivierung des Typ-III Translokons.
In dieser Arbeit steht der Pathogenitätsfaktor OspD1 im Vordergrund, dessen
Wechselwirkung mit dem Chaperon Spa15 sowie mit dem Transkriptionsregulator
MxiE biochemisch und kristallographisch untersucht wurde. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde ein verbessertes Expressionssystem für OspD1 mit einem MaltoseBindeprotein-Fusionsanteil etabliert, um das Protein rein darzustellen.
Kristallisationsversuche zeigten Bedingungen, unter denen es möglich war, OspD1- Kristalle bei 4 °C wachsen zu lassen. Nach einigen Verbesserungen konnte ein
nativer Datensatz mit einer Auflösung von 2,34 Å gesammelt werden. Jedoch war es
trotz intensiver Bemühungen im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich die Struktur
aufzuklären. Versuche, den gesammelten Datensatz mittels Molecular Replacement
zu lösen, waren aufgrund des Fehlens eines geeigneten Strukturmodells mit
ausreichend Homologie nicht erfolgreich. Bei zahlreichen darauffolgenden
Versuchen, die Struktur mit Hilfe von Schwermetallderivaten aufzuklären, konnten
Datensätze gesammelt werden, welche allerdings nicht auswertbar waren. Ein
Selenomethioninderivat, welches die Strukturaufklärung mittels eines MADExperiments ermöglichen sollte, wurde erfolgreich exprimiert, konnte aber final aufgereinigt werden.
Um die Wechselwirkung von Spa15 mit OspD1 dennoch kristallographisch
zu charakterisieren, wurden zum einen Kristallisationsversuche des Komplexes
unternommen und zum anderen Peptide unterschiedlicher Länge von OspD1
synthetisiert, deren Sequenz in dem Bereich der Interaktion mit Spa15 liegt.
Die quantitative Untersuchung von Proteinwechselwirkungen zwischen
Spa15 und OspD1 erfolgte durch die Microscale Thermophorese. Diese relativ neu
entwickelte Methode beruht auf der gerichteten Bewegung von Molekülen entlang
eines Temperaturgradienten, welche durch das Binden eines Liganden messbar und
konzentrationsabhängig beeinflusst wird. Hier gelang es, die Wechselwirkung von
Spa15 und OspD1 auf einen KD von etwa 40 nM zu determinieren. Danach wurden
die verschiedenen OspD1-Peptide mit Spa15 vermessen, um zu ermitteln, wie gut die einzelnen Peptide binden und wie hoch der Verlust der Bindungsstärke im Vergleich zum obengenannten KD Volllängenprotein war.
Desweiteren war es mit dieser Methode möglich, die im Rahmen von
Christian Hasewinkels Dissertation angefertigten MxiE-Peptide mit OspD1 zu
vermessen und dabei eine Bindung bei einem KD von 100 nM und 500 nM für zwei
MxiE Peptide zu detektieren. Ebenso wurde die Bindung von MxiE- und IpaCPeptiden an das Chaperon IpgC untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden
ebenfalls Kristallisationsversuche mit jeweils den beiden bindungsstärksten Peptiden unternommen. Nach Optimierung der dabei gefundenen Kristallisationsbedingungen wurde ein Datensatz mit einer Auflösung von 2,6 Å erhalten. Nach Lösung der Struktur konnte allerdings kein Peptid in der Kristallstruktur gefunden werden. Zur weiteren biochemischen Charakterisierung von IpgC wurde die Fragmentbibliothek der AG Klebe (über 360 Fragmente) mit Hilfe des Thermal Shift Assays vermessen.
Hierbei konnte kein Fragment ermittelt werden, welches zu einer signifikanten
thermischen Stabilisierung von IpgC führte. |
|---|---|
| Umfang: | 197 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2017.0070 |