Strukturbasierte Entwicklung und Charakterisierung von Inhibitoren der TGT,ein mögliches Ziel zur Therapie der Bakterienruhr

Das Zielenzym TGT hat eine essentielle Bedeutung für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankung Bakterienruhr, die durch Shigellen verursacht wird. Die TGT tauscht dazu die Purinbase Guanin in der Wobble Position-34 von verschiedenen tRNAs durch die modifizierte Base preQ1 aus. Die von den Pur...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Main Author: Ehrmann, Frederik Rainer
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof.Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
TGT
Online Access:PDF Full Text
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Description
Summary:Das Zielenzym TGT hat eine essentielle Bedeutung für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankung Bakterienruhr, die durch Shigellen verursacht wird. Die TGT tauscht dazu die Purinbase Guanin in der Wobble Position-34 von verschiedenen tRNAs durch die modifizierte Base preQ1 aus. Die von den Purinbasen abgeleiteten lin-Benzoguanin Inhibitoren binden im aktiven Zentrum der Basenaustauschreaktion. Durch Anfügen von Substituenten können die benachbarten Ribose-33 und Ribose-34-Taschen adressiert werden. In zwei Studien wurden die Wassernetzwerke der genannten Seitentaschen ladungsneutral durch Monosaccharid-Substituenten der lin-Benzoguanin Inhibitoren adressiert und verdrängt. Dabei binden die Furanosyl-Substituenten räumlich gesehen in einer vergleichbaren Region wie die Phosphatgruppe-35 des natürlichen tRNA-Substrats. Dies lässt den Rückschluss zu, dass Furanoside als mögliche Surrogate für die Adressierung von Phosphatbindetaschen geeignet sind. Da die TGT nur als Homodimer das natürliche tRNA-Substrat modifiziert, kommen als Inhibitionsmechanismen sowohl die Blockierung des aktiven Zentrums, als auch die Störung der dimeren Quartärstruktur der TGT, in Frage. Die Kontaktfläche der zwei TGT Monomere liegt in unmittelbarer Nähe zu der Ribose-34-Tasche. Bei der Analyse der Kokristallstrukturen der Furanosyl-substituierten Inhibitoren fiel auf, dass durch Adressierung des hydrophoben Bereichs der Seitentasche ein angrenzendes Loop-Helix Motiv in seiner geometrischen Integrität gestört wird. Da dieses Motiv entscheidend zur Dimerstabilität beiträgt und die Umlagerungen nur in Kokristallstrukturen auftreten, wurden in einer vertieften Studie bereits charakterisierte Liganden kokristallisiert, von denen zuvor nur eine durch die Soaking-Methode erhaltene Kristallstruktur vorlag. Die Analyse dieser Kokristallstrukturen offenbarte zum einen andere Bindungsmodi als in den Soaking-Kristallstrukturen und bestätigte zum anderen weitere Liganden, die das Interface der TGT stören. Die Dimer-destabilisierende Wirkung dieser Liganden wurde durch native Massenspektroskopie bestätigt. Ein Ligand induziert durch seine Bindung eine neuartige Ausrichtung des TGT-Dimers (verdrehtes Dimer), welche offensichtlich aufgrund der verdrehten Neuausrichtung nicht mehr katalytisch aktiv sein kann. In einer Folgestudie konnten drei Inhibitoren charakterisiert werden, die ebenfalls die Dimerisierung der TGT stören. Zwei dieser Verbindungen kokristallisieren sowohl in dem konventionellen, als auch in dem verdrehten Dimer. Eine weitere Studie verfolgte den Prodrug-Ansatz. Da die lin-Benzoguanin-Inhibitoren nicht membrangängig sind, wurde das Grundgerüst mit unterschiedlichen Carbamat-Substituenten versehen. Infolge konnten PAMPA-Messungen zum ersten Mal membrangängige Liganden der TGT bestätigen. In einer Art retrospektiven Arbeit wurden die Bindungsbeiträge der Aminosäuren der Guanin 34/preQ1 Tasche auf die Affinitäten der untersuchten Liganden aufgeklärt. Anhand von Benzimidazol-Derivaten wurde eine zuvor durch eine MD-Simulation prognostizierte Taschenerweiterung erstmals in Kokristallstrukturen experimentell bestätigt. Sowohl Hydrazid-, als auch Guanidin-Substituenten des Benzimidazol-Grundkörpers, stabilisieren aufgrund ihres sterischen Drucks auf Asp156 und der Solvatisierung von Gln203 und Gly230 die transiente Taschenerweiterung. In zukünftigen Designzyklen könnten die Guanidin-Benzimidazole derivatisiert werden, um den neuen Hohlraum zu adressieren und so neue Affinitätspotentiale zu nutzen. Ein weiteres Projekt verfolgte die Charakterisierung eines Nukleosidderivats, welches als mögliches Übergangszustand-Analogon die Basenaustauschreaktion der TGT inhibiert. Der entwickelte Deazaguanin-basierte Inhibitor stellt eine neue Verbindungsklasse und mögliche Leitstruktur dar, die in Zukunft die etablierten lin-Benzoguanine ablösen könnte. In einem größer angelegten Projekt wurde von neun Kristallographen der AG Klebe die in-house Fragmentbibliothek durch Soaking-Kristallstrukturen an das Zielenzym Endothiapepsin röntgenkristallographisch durchgemustert. Von 361 Soaking Kristallstrukturen wurden 71 Komplexstrukturen (Trefferquote 20%) erhalten. Im Zuge dieses Projektes wurde auch ein standardisiertes Verfeinerungsprotokoll entwickelt, welches die Identifizierung von Fragmenten in Kristallstrukturen optimiert und automatisiert. Aufgrund der strukturellen Information der Fragmente in den Kristallstrukturen konnten zum einen neue funktionelle Gruppen zur Adressierung der katalytischen Diade, als auch drei Hotspots abseits des aktiven Zentrums, identifiziert werden. Neben der Demaskierung eines falsch-positiven Treffers aus biophysikalischen Screening-Verfahren, wurde auch offensichtlich, dass die in der Praxis häufig verwendeten biophysikalischen Methoden zum Vor-Screening von Fragmentbibliotheken die Anzahl der Treffer und somit mögliche Röntgenkomplexstrukturen nicht unbedingt erhöht sondern gegebenenfalls reduziert.
Physical Description:223 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2017.0064