Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie

Eukaryoten und Prokaryoten unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome. Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom, welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare Chromosomen, die mehr als einen Replikationsurspr...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Milbredt, Sarah
Beteiligte: Waldminghaus, T. (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2016
Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Eukaryoten und Prokaryoten unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome. Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom, welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare Chromosomen, die mehr als einen Replikationsursprung enthalten. In wie weit die prokaryotische Genomorganisation der eukaryotischen angepasst werden kann, ist eine spannende Frage, von deren Antwort grundlegende Konstruktionsregeln für die Entwicklung von synthetischen Chromosomen abgeleitet werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Escherichia coli Stämme mit multiplen Replikationsursprüngen und Chromosomen bezüglich ihrer DNA-Replikation untersucht und es wurde eine fluoreszenzbasierte Einzelzell-Methode designt und etabliert, die eine verbesserte „signal to background ratio“ aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: I. E. coli toleriert einen zusätzlichen Replikationsursprung auf dem Chromosom, der aktiv repliziert. Dieser Ansatz funktioniert sowohl mit einer zusätzlichen Kopie von oriC, als auch mit oriII, dem Replikationsursprung des zweiten Chromosoms von V. cholerae. Es konnte gezeigt werden, dass eine verkürzte oriC-Sequenz, die keine DnaA-Box R4 enthält, nicht ausreichend für die DNA-Replikation auf dem nativen Chromosom ist. Wird oriII als extra Replikationsursprung eingesetzt, verläuft die DNA-Replikation dysreguliert. Diese Dysregulation wird aufgehoben, sobald sich oriC und oriII nicht mehr auf dem gleichen Chromosom, sondern auf zwei unterschiedlichen Replikons befinden. II. Für das Design und die Assemblierung von DNA-Sequenzbibliotheken zur chromosomalen Integration in Bakterien wurde das Programm MARSeG (Motif Avoiding Randomized Sequence Generator) geschrieben und das MoClo-System optimiert. Mit dem Sequenzgenerator MARSeG, ist es möglich Sequenzen zu designen, die eine hohe Variabilität aufweisen und gleichzeitig bestimmte DNA-Motive ausschließen. Das MoClo-System wurde optimiert um die Klonierungseffizienz zu erhöhen, Assemblierungen im Bibliotheken-Maßstab zu vereinfachen und eine Genomintegration assemblierter DNA-Fragmente einfacher zu gestalten. Mit Hilfe von MARSeG und den modifizierten MoClo-Vektoren konnte das Design und der Aufbau eines LacO/TetO hybrid FROS-Arrays effizient und schnell vollzogen werden. III. Es wurde eine neue Einzelzell-Methode etabliert mit der das Hintergrundsignal konventioneller FROS (Fluorescence Repressor Operator System) stark reduziert wird. Die neue Methode BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and Repressor Operator System) basiert auf Fusionen aus Repressoren und fragmentierten Fluoreszenzproteinen, die an ein hybrid FROS-Array binden, wodurch es durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation zu einem Fluoreszenzsignal kommt. BiFCROS enthält im Vergleich zum konventionellen FROS eine deutlich verminderte Hintergrundfluoreszenz, weil nur Proteine fluoreszieren, die an das Operator-Array gebunden sind. Um zu analysieren, ob BiFCROS für die Kopienzahlbestimmung von Genloki eingesetzt werden könnte, wurde es in diese Richtung weiterentwickelt. Anhand der Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle könnte Rückschluss auf die Kopienzahl des hybrid FROS-Arrays gezogen werden, weil diese mit Anstieg der Kopienzahl proportional zunehmen sollte.
Beschreibung:83 pages.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2016.0943