Vergleichende Analyse von basaler und stressinduzierter Expression sowie Lokalisation der Hitzeschockproteine von 70 Kilodalton Molekulargewicht HSPA1A und HSPA1B (Hsp70) bei humanen Tumorzellen

Im Gegensatz zu gesunden humanen Zellen weisen Tumorzellen eine erhöhte basale Expression von HSPA1A und HSPA1B (Hsp70) auf und exponieren die Chaperone auf ihren Zelloberflächen. Stressinduziert wird Hsp70 allgemein verstärkt exprimiert, was nicht nur zytoprotektive, sondern auch zytotoxische Effek...

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Main Author: Schink, Christian Wolfgang
Contributors: Jacob, Ralf (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
Medizin
Subjects:
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Description
Summary:Im Gegensatz zu gesunden humanen Zellen weisen Tumorzellen eine erhöhte basale Expression von HSPA1A und HSPA1B (Hsp70) auf und exponieren die Chaperone auf ihren Zelloberflächen. Stressinduziert wird Hsp70 allgemein verstärkt exprimiert, was nicht nur zytoprotektive, sondern auch zytotoxische Effekte auslösen kann. Auch der Export von freiem Hsp70 und die Sekretion von Hsp70 enthaltenden extrazellulären Vesikel werden unter Stressbedingungen intensiviert, was immunstimulatorische Wirkungen hervorrufen kann. Allerdings können basale und stressinduzierte Expressions- und Lokalisationsmuster von Hsp70 bei einzelnen Tumorzelltypen variieren. Eine einheitliche Korrelation zwischen Expressionsintensität und Behandlungsprognose konnte bislang nicht hergestellt werden. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit MCF7-Brust-Adenokarzinom-, T47D-Brust-Duktalkarzinom- und U2OS-Osteosarkom-Zellen bezüglich basaler Expressionsintensität, Verlauf und Ausprägung der Stressantwort sowie Lokalisation von Hsp70 charakterisiert. Zur biochemischen Charakterisierung der basalen und stressinduzierten Expressionsmuster wurden ungestresste und gestresste Zellen homogenisiert, mittels differentieller Zentrifugation in zellkernfreie Homogenate, Zytosol- und Membranfraktionen getrennt und mittels Gelelektrophorese, Westernblot sowie densitometrischer Quantifizierung analysiert. Hierbei zeigte sich, dass T47D- und MCF7-Zellen unter physiologischen Bedingungen mehr Hsp70 exprimierten als U2OS-Zellen. Die Höhen der basalen Expressionsniveaus bestimmten die Intensitäten der Stressantworten: Je mehr Hsp70 die Zellen unter physiologischen Bedingungen synthetisierten, desto schwächer fielen die stressinduzierten Expressionssteigerungen aus. Davon abgesehen zeigten die Tumorzelllinien auch auffällige Gemeinsamkeiten. So verliefen die stressinduzierten Hsp70-Expressionsschwankungen in Zytosol- und Membranfraktionen stets vergleichbar, die Verhältnisse von zytosolischem zu Membran-assoziiertem Hsp70 blieben konstant. Die Expressionssteigerungen erreichten die Maxima bei allen drei Tumorzelllinien vier bis sechs Stunden nach Stressexposition. Auch die zwischen sechs und 24 Stunden auftretenden Expressionsreduktionsraten waren ähnlich ausgeprägt. Bezüglich der Expressionsmuster des konstitutiv exprimierten Hsc70 zeigten die T47D-Zellen hingegen Besonderheiten: Diese Zellen exprimierten bereits unter physiologischen Bedingungen nur wenig Hsc70 und reduzierten die Expression nach Stressexposition, während MCF7- und U2OS-Zellen die Synthese verstärkten. Dies lässt vermuten, dass zytotoxische Effekte die maximal erreichbaren Expressionsniveaus der Chaperone begrenzen. Die Analyse der subzellulären Lokalisationsmuster wurde mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung unpermeabilisierter und permeabilisierter Zellen realisiert. Hierbei zeigten sich entweder keine (T47D, MCF7) oder nur geringfügige (U2OS) Unterschiede zwischen ungestressten und gestressten Zellen. Hsp70 blieb innerhalb der Zellen überwiegend gleichmäßig verteilt, die subzellulären Lokalisationsmuster blieben weitgehend konstant. Dementsprechend kann davon ausgegangen werden, dass die bei anderen Tumorzelltypen beobachtete stressinduzierte nukleäre Akkumulation von Hsp70 kein genereller Bestandteil der Stressantwort ist. Auf den Oberflächen der unpermeabilisierten Zellen kolokalisierte Hsp70 mit GAPDH und α-Tubulin in sphärisch oder globulär erscheinenden Clustern von drei (MCF7) bis zehn (T47D, U2OS) Mikrometern Durchmesser. Die Formen und Größen der Cluster sowie das Vorhandensein von Alix in der unmittelbaren Umgebung derselben deuten darauf hin, dass es sich bei diesen um extrazelluläre Vesikel ähnlich den großen Onkosomen handeln könnte. Des Weiteren waren auch LDH, Centrin, Untereinheiten von Na+/K+-ATPasen und Galektin-3 auf den Oberflächen der Tumorzellen detektierbar. Die Lokalisationsmuster einiger der letztgenannten Proteine variierten zwischen den Tumorzelllinien jedoch erheblich. Dies lässt darauf schließen, dass die Komposition der auf den vesikulären Strukturen vorhandenen Proteine für einzelne Tumorzelltypen spezifisch sein könnte. Zusammenfassend betrachtet lassen die Ergebnisse der biochemischen Analysen vermuten, dass die Stressresistenz von Tumorzellen nicht nur durch die Höhe des basalen Hsp70-Expressionsniveaus determiniert wird. Vielmehr scheint auch die Menge des über die basale Expression hinaus noch synthetisierbaren Hsp70 eine Rolle zu spielen. Die Resultate der immunfluoreszenzmikroskopischen Analysen weisen darüber hinaus darauf hin, dass die Freisetzung großer extrazellulärer Vesikel kein Merkmal bestimmter Tumorzelltypen, sondern ein relativ weit verbreitetes Phänomen sein könnte. Die Konzentration immunaktivierender Moleküle auf den Vesikeln sowie die Abschnürung derselben könnte es den Tumorzellen ermöglichen, die gegen sie gerichtete Reaktion des Immunsystems zu unterlaufen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2016.0882