Analysis of the regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ from Escherichia coli

Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) is a widespread second messenger regulating several processes including bacterial motility, biofilm formation, and virulence. The enzymes responsible for c-di-GMP production and degradation, diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases (PDEs), respectively, are ab...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Lacanna, Egidio
Beteiligte: Becker, Anke (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2016
Biologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2016.0808
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Inhaltsangabe:
  • Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP) ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der verschiedenste zelluläre Prozesse reguliert, einschließlich bakterieller Motilität, Biofilmbildung und Virulenz. Die c-di-GMP-Menge in der Zelle wird von zwei Enzym-Typen reguliert: sogenannten Diguanylat-Zyklasen (DGCs), die c-di-GMP synthetisieren, und Phosphodiesterasen (PDEs), die es abbauen. DGCs besitzen eine charakteristische GGDEF-Domäne, während PDEs entweder eine EAL- oder eine HD-GYP Domäne aufweisen. In Escherichia coli K-12 MG1655 wurden 29 Proteine identifiziert, die eine GGDEF- und/oder eine EAL-Domäne aufweisen. In E. coli hat die Diguanylat-Zyklase DgcZ (früher YdeH) den größten Einfluss auf die c-di-GMP-abhängige Produktion des Exopolysaccharids Poly-N-Acetylglucosamine (Poly-GlcNAc, PGA), das wiederum bei der Biofilmbildung eine Rolle spielt. DgcZ verfügt über eine GGDEF-Domäne, welche verantwortlich für die c-di-GMP-Produktion ist, sowie über eine sensorische Domäne. Diese wurde erstmals im Chemorezeptor TlpD von Helicobacter pylori identifiziert und aufgrund ihrer Fähigkeit, Zink zu binden, Chemorezeptor-Zink-Binde-Domäne (CZB-Domäne) genannt. Forscher vom Biozentrum der Universität Basel haben die dreidimensionale Struktur des DgcZ-Proteins gelöst und dabei tatsächlich ein Zink-Ion im 3His/1Cys-Motiv der CZB-Domäne entdeckt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Aktivität von DgcZ in vitro durch Zink mit einer Konstante Ki im subfemtomolaren Bereich gehemmt wird. Die vorliegende Studie untersucht die Regulation und Funktion der Diguanylat-Zyklase DgcZ in E. coli. Um den Einfluss von Zink auf die Aktivität von DgcZ in vivo zu analysieren, wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese dgcZ-Allele konstruiert, in deren Proteinprodukten die für die Zink-Koordination verantwortlichen Aminosäuren ausgetauscht waren, wodurch die Affinität von Zink reduziert oder vollständig aufgehoben wurde. Die Aktivität dieser DgcZ-Varianten wurde durch Messung der Menge an PgaD bestimmt, eines Enzyms im Exopolysaccharid-Syntheseweg, und der Menge des Exopolysaccharids Poly-GlcNAc (PGA); beides ist proportional zur c-di-GMP-Produktion durch DgcZ. Während einzelne Mutationen in der CZB-Domäne die Proteinaktivität geringfügig beeinflussten, zeigte eine DgcZ-Variante mit zwei Aminosäureaustäuschen (H79L und H83L) eine deutliche Steigerung der Proteinaktivität. Der Einfluss von Zink-Ionen auf die Aktivität von DgcZ wurde darüber hinaus untersucht, indem bei steigenden Konzentrationen von ZnSO4 im Medium die Fähigkeit der Bakterien zur Bildung eines PGA-Biofilms ermittelt wurde: Wird Zink extern hinzugegeben, hemmt es die PGA-Biofilmbildung in einer DgcZ- und c-di-GMP-abhängigen Art und Weise. Die in vivo-Ergebnisse bestätigen damit die in vitro-Experimente und belegen, dass die Diguanylat-Zyklase DgcZ allosterisch durch Zink reguliert wird. Die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus ist noch offen; mögliche Erklärungsansätze wären, dass er den Bakterien hilft, zwischen Nischen mit hohen und niedrigen Zink-Konzentrationen zu unterscheiden, oder den metabolischen Zustand der Bakterienzelle selbst widerspiegelt. Neben diesen Studien zur allosterischen Kontrolle wurde die physiologische Rolle von DgcZ untersucht, denn dessen primäre Funktion und die Bedingungen, unter denen das Protein aktiv ist, sind nach wie vor nicht ausreichend verstanden. DgcZ-Lokalisationsstudien im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass es bei einer Kombination von Kohlenstoffmangel und alkalischem pH (8,7) zu einer Lokalisation an einem Pol der Bakterienzelle kommt. Diese Lokalisation konnte nur bei sich nicht teilenden Bakterien beobachtet werden und ist bei erneuter Nährstoffgabe reversibel. Auf eine eventuelle Funktion dieses Phänotyps gibt es bis jetzt allerdings keine Hinweise. Des Weiteren wurden Co-Immunpräzipitation-Experimente durchgeführt, in deren Verlauf 11 Proteine identifiziert werden konnten. Unter diesen 11 Proteinen war auch FrdB, eine Untereinheit des Fumarat-Reduktase-Komplexes (FRD), für die anschließend eine Interaktion mit DgcZ mittels eines bakteriellen Zwei-Hybrid-System bestätigt werden konnte. Darüber hinaus erwies sich der FRD-Komplex als essenziell in einer Superoxid-stimulierten Zunahme von DgcZ abhängigen Biofilmen, was auf eine neue Rolle dieses Komplex einerseits und von oxidativem Stress andererseits in der DgcZ-abhängigen Biofilm-Bildung hindeutet. Abschließend wurde die Rolle von DgcZ in der durch CpxAR vermittelten Oberflächenadhäsion untersucht, denn es war bekannt, dass dgcZ durch dieses Zweikomponentensystem transkriptionell reguliert wird. Der Cpx-Komplex wiederum ist für die Oberflächendetektion verantwortlich und stimuliert die Zelladhäsion durch einen bislang unbekannten Mechanismus. Diese Arbeit zeigt nun eine Beteiligung von DgcZ in der Cpx-vermittelten Oberflächenadhäsion und belegt damit eine physiologische Funktion dieser Diguanylat-Zyklase im Übergang von Oberflächendetektion zur Adhäsion.