Analysis of the regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ from Escherichia coli

Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) is a widespread second messenger regulating several processes including bacterial motility, biofilm formation, and virulence. The enzymes responsible for c-di-GMP production and degradation, diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases (PDEs), respectively, are ab...

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1. Verfasser: Lacanna, Egidio
Beteiligte: Becker, Anke (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2016
Biologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2016.0808
Schlagworte:
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Diguanylat-Zyklase
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Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP)
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Zink
Diguanylate cyclase
Escherichia coli
Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP)
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DgcZ
Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP)
Biofilm
Zink
Diguanylate cyclase
Escherichia coli
Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP)
Biowissenschaften, Biologie
Analysis of the regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ from Escherichia coli
Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP) ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der verschiedenste zelluläre Prozesse reguliert, einschließlich bakterieller Motilität, Biofilmbildung und Virulenz. Die c-di-GMP-Menge in der Zelle wird von zwei Enzym-Typen reguliert: sogenannten Diguanylat-Zyklasen (DGCs), die c-di-GMP synthetisieren, und Phosphodiesterasen (PDEs), die es abbauen. DGCs besitzen eine charakteristische GGDEF-Domäne, während PDEs entweder eine EAL- oder eine HD-GYP Domäne aufweisen. In Escherichia coli K-12 MG1655 wurden 29 Proteine identifiziert, die eine GGDEF- und/oder eine EAL-Domäne aufweisen. In E. coli hat die Diguanylat-Zyklase DgcZ (früher YdeH) den größten Einfluss auf die c-di-GMP-abhängige Produktion des Exopolysaccharids Poly-N-Acetylglucosamine (Poly-GlcNAc, PGA), das wiederum bei der Biofilmbildung eine Rolle spielt. DgcZ verfügt über eine GGDEF-Domäne, welche verantwortlich für die c-di-GMP-Produktion ist, sowie über eine sensorische Domäne. Diese wurde erstmals im Chemorezeptor TlpD von Helicobacter pylori identifiziert und aufgrund ihrer Fähigkeit, Zink zu binden, Chemorezeptor-Zink-Binde-Domäne (CZB-Domäne) genannt. Forscher vom Biozentrum der Universität Basel haben die dreidimensionale Struktur des DgcZ-Proteins gelöst und dabei tatsächlich ein Zink-Ion im 3His/1Cys-Motiv der CZB-Domäne entdeckt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Aktivität von DgcZ in vitro durch Zink mit einer Konstante Ki im subfemtomolaren Bereich gehemmt wird. Die vorliegende Studie untersucht die Regulation und Funktion der Diguanylat-Zyklase DgcZ in E. coli. Um den Einfluss von Zink auf die Aktivität von DgcZ in vivo zu analysieren, wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese dgcZ-Allele konstruiert, in deren Proteinprodukten die für die Zink-Koordination verantwortlichen Aminosäuren ausgetauscht waren, wodurch die Affinität von Zink reduziert oder vollständig aufgehoben wurde. Die Aktivität dieser DgcZ-Varianten wurde durch Messung der Menge an PgaD bestimmt, eines Enzyms im Exopolysaccharid-Syntheseweg, und der Menge des Exopolysaccharids Poly-GlcNAc (PGA); beides ist proportional zur c-di-GMP-Produktion durch DgcZ. Während einzelne Mutationen in der CZB-Domäne die Proteinaktivität geringfügig beeinflussten, zeigte eine DgcZ-Variante mit zwei Aminosäureaustäuschen (H79L und H83L) eine deutliche Steigerung der Proteinaktivität. Der Einfluss von Zink-Ionen auf die Aktivität von DgcZ wurde darüber hinaus untersucht, indem bei steigenden Konzentrationen von ZnSO4 im Medium die Fähigkeit der Bakterien zur Bildung eines PGA-Biofilms ermittelt wurde: Wird Zink extern hinzugegeben, hemmt es die PGA-Biofilmbildung in einer DgcZ- und c-di-GMP-abhängigen Art und Weise. Die in vivo-Ergebnisse bestätigen damit die in vitro-Experimente und belegen, dass die Diguanylat-Zyklase DgcZ allosterisch durch Zink reguliert wird. Die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus ist noch offen; mögliche Erklärungsansätze wären, dass er den Bakterien hilft, zwischen Nischen mit hohen und niedrigen Zink-Konzentrationen zu unterscheiden, oder den metabolischen Zustand der Bakterienzelle selbst widerspiegelt. Neben diesen Studien zur allosterischen Kontrolle wurde die physiologische Rolle von DgcZ untersucht, denn dessen primäre Funktion und die Bedingungen, unter denen das Protein aktiv ist, sind nach wie vor nicht ausreichend verstanden. DgcZ-Lokalisationsstudien im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass es bei einer Kombination von Kohlenstoffmangel und alkalischem pH (8,7) zu einer Lokalisation an einem Pol der Bakterienzelle kommt. Diese Lokalisation konnte nur bei sich nicht teilenden Bakterien beobachtet werden und ist bei erneuter Nährstoffgabe reversibel. Auf eine eventuelle Funktion dieses Phänotyps gibt es bis jetzt allerdings keine Hinweise. Des Weiteren wurden Co-Immunpräzipitation-Experimente durchgeführt, in deren Verlauf 11 Proteine identifiziert werden konnten. Unter diesen 11 Proteinen war auch FrdB, eine Untereinheit des Fumarat-Reduktase-Komplexes (FRD), für die anschließend eine Interaktion mit DgcZ mittels eines bakteriellen Zwei-Hybrid-System bestätigt werden konnte. Darüber hinaus erwies sich der FRD-Komplex als essenziell in einer Superoxid-stimulierten Zunahme von DgcZ abhängigen Biofilmen, was auf eine neue Rolle dieses Komplex einerseits und von oxidativem Stress andererseits in der DgcZ-abhängigen Biofilm-Bildung hindeutet. Abschließend wurde die Rolle von DgcZ in der durch CpxAR vermittelten Oberflächenadhäsion untersucht, denn es war bekannt, dass dgcZ durch dieses Zweikomponentensystem transkriptionell reguliert wird. Der Cpx-Komplex wiederum ist für die Oberflächendetektion verantwortlich und stimuliert die Zelladhäsion durch einen bislang unbekannten Mechanismus. Diese Arbeit zeigt nun eine Beteiligung von DgcZ in der Cpx-vermittelten Oberflächenadhäsion und belegt damit eine physiologische Funktion dieser Diguanylat-Zyklase im Übergang von Oberflächendetektion zur Adhäsion.
Lacanna, Egidio
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contents Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP) ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der verschiedenste zelluläre Prozesse reguliert, einschließlich bakterieller Motilität, Biofilmbildung und Virulenz. Die c-di-GMP-Menge in der Zelle wird von zwei Enzym-Typen reguliert: sogenannten Diguanylat-Zyklasen (DGCs), die c-di-GMP synthetisieren, und Phosphodiesterasen (PDEs), die es abbauen. DGCs besitzen eine charakteristische GGDEF-Domäne, während PDEs entweder eine EAL- oder eine HD-GYP Domäne aufweisen. In Escherichia coli K-12 MG1655 wurden 29 Proteine identifiziert, die eine GGDEF- und/oder eine EAL-Domäne aufweisen. In E. coli hat die Diguanylat-Zyklase DgcZ (früher YdeH) den größten Einfluss auf die c-di-GMP-abhängige Produktion des Exopolysaccharids Poly-N-Acetylglucosamine (Poly-GlcNAc, PGA), das wiederum bei der Biofilmbildung eine Rolle spielt. DgcZ verfügt über eine GGDEF-Domäne, welche verantwortlich für die c-di-GMP-Produktion ist, sowie über eine sensorische Domäne. Diese wurde erstmals im Chemorezeptor TlpD von Helicobacter pylori identifiziert und aufgrund ihrer Fähigkeit, Zink zu binden, Chemorezeptor-Zink-Binde-Domäne (CZB-Domäne) genannt. Forscher vom Biozentrum der Universität Basel haben die dreidimensionale Struktur des DgcZ-Proteins gelöst und dabei tatsächlich ein Zink-Ion im 3His/1Cys-Motiv der CZB-Domäne entdeckt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Aktivität von DgcZ in vitro durch Zink mit einer Konstante Ki im subfemtomolaren Bereich gehemmt wird. Die vorliegende Studie untersucht die Regulation und Funktion der Diguanylat-Zyklase DgcZ in E. coli. Um den Einfluss von Zink auf die Aktivität von DgcZ in vivo zu analysieren, wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese dgcZ-Allele konstruiert, in deren Proteinprodukten die für die Zink-Koordination verantwortlichen Aminosäuren ausgetauscht waren, wodurch die Affinität von Zink reduziert oder vollständig aufgehoben wurde. Die Aktivität dieser DgcZ-Varianten wurde durch Messung der Menge an PgaD bestimmt, eines Enzyms im Exopolysaccharid-Syntheseweg, und der Menge des Exopolysaccharids Poly-GlcNAc (PGA); beides ist proportional zur c-di-GMP-Produktion durch DgcZ. Während einzelne Mutationen in der CZB-Domäne die Proteinaktivität geringfügig beeinflussten, zeigte eine DgcZ-Variante mit zwei Aminosäureaustäuschen (H79L und H83L) eine deutliche Steigerung der Proteinaktivität. Der Einfluss von Zink-Ionen auf die Aktivität von DgcZ wurde darüber hinaus untersucht, indem bei steigenden Konzentrationen von ZnSO4 im Medium die Fähigkeit der Bakterien zur Bildung eines PGA-Biofilms ermittelt wurde: Wird Zink extern hinzugegeben, hemmt es die PGA-Biofilmbildung in einer DgcZ- und c-di-GMP-abhängigen Art und Weise. Die in vivo-Ergebnisse bestätigen damit die in vitro-Experimente und belegen, dass die Diguanylat-Zyklase DgcZ allosterisch durch Zink reguliert wird. Die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus ist noch offen; mögliche Erklärungsansätze wären, dass er den Bakterien hilft, zwischen Nischen mit hohen und niedrigen Zink-Konzentrationen zu unterscheiden, oder den metabolischen Zustand der Bakterienzelle selbst widerspiegelt. Neben diesen Studien zur allosterischen Kontrolle wurde die physiologische Rolle von DgcZ untersucht, denn dessen primäre Funktion und die Bedingungen, unter denen das Protein aktiv ist, sind nach wie vor nicht ausreichend verstanden. DgcZ-Lokalisationsstudien im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass es bei einer Kombination von Kohlenstoffmangel und alkalischem pH (8,7) zu einer Lokalisation an einem Pol der Bakterienzelle kommt. Diese Lokalisation konnte nur bei sich nicht teilenden Bakterien beobachtet werden und ist bei erneuter Nährstoffgabe reversibel. Auf eine eventuelle Funktion dieses Phänotyps gibt es bis jetzt allerdings keine Hinweise. Des Weiteren wurden Co-Immunpräzipitation-Experimente durchgeführt, in deren Verlauf 11 Proteine identifiziert werden konnten. Unter diesen 11 Proteinen war auch FrdB, eine Untereinheit des Fumarat-Reduktase-Komplexes (FRD), für die anschließend eine Interaktion mit DgcZ mittels eines bakteriellen Zwei-Hybrid-System bestätigt werden konnte. Darüber hinaus erwies sich der FRD-Komplex als essenziell in einer Superoxid-stimulierten Zunahme von DgcZ abhängigen Biofilmen, was auf eine neue Rolle dieses Komplex einerseits und von oxidativem Stress andererseits in der DgcZ-abhängigen Biofilm-Bildung hindeutet. Abschließend wurde die Rolle von DgcZ in der durch CpxAR vermittelten Oberflächenadhäsion untersucht, denn es war bekannt, dass dgcZ durch dieses Zweikomponentensystem transkriptionell reguliert wird. Der Cpx-Komplex wiederum ist für die Oberflächendetektion verantwortlich und stimuliert die Zelladhäsion durch einen bislang unbekannten Mechanismus. Diese Arbeit zeigt nun eine Beteiligung von DgcZ in der Cpx-vermittelten Oberflächenadhäsion und belegt damit eine physiologische Funktion dieser Diguanylat-Zyklase im Übergang von Oberflächendetektion zur Adhäsion.
institution Biologie
physical 137 pages.
author Lacanna, Egidio
description Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) is a widespread second messenger regulating several processes including bacterial motility, biofilm formation, and virulence. The enzymes responsible for c-di-GMP production and degradation, diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases (PDEs), respectively, are abundant and often present in multiple copies within bacterial genomes. DGCs possess a characteristic GGDEF domain, whereas PDEs have either an EAL or an HD-GYP domain. In the Escherichia coli K-12 strain MG1655, 29 proteins containing GGDEF and/or EAL domains have been identified. In E. coli, the diguanylate cyclase DgcZ (formerly YdeH) is the major DGC controlling the production of the exopolysaccharide poly-N-Acetylglucosamine (poly-GlcNAc, PGA), which is involved in biofilm formation. DgcZ contains a GGDEF domain, responsible for c-di-GMP production, and a sensory domain. First identified in the chemoreceptor TlpD of Helicobacter pylori, this domain was named chemoreceptor zinc-binding (CZB) domain after its capability to bind zinc. Researchers from the University of Basel’s Biozentrum solved the three-dimensional structure of the DgcZ protein and indeed found a zinc ion bound to the 3His/1Cys motif of the CZB domain. Additionally, zinc was shown to inhibit the activity of DgcZ in vitro with a subfemtomolar constant Ki. This study investigates the regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ in E. coli. To ascertain the role of zinc in the function of DgcZ activity in vivo, site-directed mutagenesis was employed to construct dgcZ alleles encoding protein variants with amino acid exchanges in the CZB domain involved in zinc coordination, thus reducing or abolishing binding. The activity of these DgcZ variants was derived by measuring the levels of PgaD, an enzyme involved in exopolysaccharide production, and of the exopolysaccharide poly-GlcNAc (PGA) produced, both proportional to DgcZ-derived c-di-GMP. Although single exchanges of zinc binding amino acids did not strongly affect the protein activity, a DgcZ variant carrying two such exchanges (H79L and H83L) displayed a significant increase of protein activity. The influence of zinc ions on DgcZ activity was further tested by applying increasing concentrations of ZnSO4 and measuring the ability of bacteria to form a PGA biofilm. Externally applied zinc inhibited PGA biofilm formation in a DgcZ- and c-di-GMP-dependent fashion. The evidence obtained in vivo therefore confirms the results from the in vitro experiments showing that the diguanylate cyclase DgcZ is allosterically regulated by zinc. The relevance of this regulatory mechanism is still unsettled, but potential explanations are that it might help the bacteria discriminate among different niches, characterized by high or low levels of zinc, or that it could “signal” the cell´s own physiological condition. Following these studies on allosteric regulation, the physiological role of DgcZ was examined, as its primary function and the conditions in which the protein is active are still not well defined. Analyses of DgcZ protein localization performed in this study revealed that a combination of carbon starvation and alkaline pH (8.7) induces localization at one bacterial cell pole. Polar localization occurred in non-dividing bacteria and disappeared after restoring nutrient-sufficient conditions. The role of this localization phenotype until now remains elusive. Further, Co-Immunoprecipitation analyses were performed and 11 proteins identified with a significant score. Among these, FrdB, a subunit of the fumarate reductase complex (FRD), interacted with DgcZ within a bacterial two-hybrid system. The FRD complex proved essential in the superoxide-stimulated increase of DgcZ-dependent biofilm, suggesting new roles of this complex and oxidative stress in DgcZ-mediated biofilm formation. Finally, the role of DgcZ in CpxAR-mediated surface adhesion was investigated, as it had already been established that dgcZ is transcriptionally regulated by this two-component system. The Cpx complex in turn had been shown to be responsible for surface sensing and to stimulate bacterial adhesion through an up to now unknown mechanism. This work reveals an involvement of DgcZ in Cpx-mediated surface adhesion, providing evidence for a physiological function of this diguanylate cyclase in connecting the processes of surface sensing and surface attachment.
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In E. coli hat die Diguanylat-Zyklase DgcZ (früher YdeH) den größten Einfluss auf die c-di-GMP-abhängige Produktion des Exopolysaccharids Poly-N-Acetylglucosamine (Poly-GlcNAc, PGA), das wiederum bei der Biofilmbildung eine Rolle spielt. DgcZ verfügt über eine GGDEF-Domäne, welche verantwortlich für die c-di-GMP-Produktion ist, sowie über eine sensorische Domäne. Diese wurde erstmals im Chemorezeptor TlpD von Helicobacter pylori identifiziert und aufgrund ihrer Fähigkeit, Zink zu binden, Chemorezeptor-Zink-Binde-Domäne (CZB-Domäne) genannt. Forscher vom Biozentrum der Universität Basel haben die dreidimensionale Struktur des DgcZ-Proteins gelöst und dabei tatsächlich ein Zink-Ion im 3His/1Cys-Motiv der CZB-Domäne entdeckt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Aktivität von DgcZ in vitro durch Zink mit einer Konstante Ki im subfemtomolaren Bereich gehemmt wird. Die vorliegende Studie untersucht die Regulation und Funktion der Diguanylat-Zyklase DgcZ in E. coli. Um den Einfluss von Zink auf die Aktivität von DgcZ in vivo zu analysieren, wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese dgcZ-Allele konstruiert, in deren Proteinprodukten die für die Zink-Koordination verantwortlichen Aminosäuren ausgetauscht waren, wodurch die Affinität von Zink reduziert oder vollständig aufgehoben wurde. Die Aktivität dieser DgcZ-Varianten wurde durch Messung der Menge an PgaD bestimmt, eines Enzyms im Exopolysaccharid-Syntheseweg, und der Menge des Exopolysaccharids Poly-GlcNAc (PGA); beides ist proportional zur c-di-GMP-Produktion durch DgcZ. Während einzelne Mutationen in der CZB-Domäne die Proteinaktivität geringfügig beeinflussten, zeigte eine DgcZ-Variante mit zwei Aminosäureaustäuschen (H79L und H83L) eine deutliche Steigerung der Proteinaktivität. Der Einfluss von Zink-Ionen auf die Aktivität von DgcZ wurde darüber hinaus untersucht, indem bei steigenden Konzentrationen von ZnSO4 im Medium die Fähigkeit der Bakterien zur Bildung eines PGA-Biofilms ermittelt wurde: Wird Zink extern hinzugegeben, hemmt es die PGA-Biofilmbildung in einer DgcZ- und c-di-GMP-abhängigen Art und Weise. Die in vivo-Ergebnisse bestätigen damit die in vitro-Experimente und belegen, dass die Diguanylat-Zyklase DgcZ allosterisch durch Zink reguliert wird. Die Bedeutung dieses regulatorischen Mechanismus ist noch offen; mögliche Erklärungsansätze wären, dass er den Bakterien hilft, zwischen Nischen mit hohen und niedrigen Zink-Konzentrationen zu unterscheiden, oder den metabolischen Zustand der Bakterienzelle selbst widerspiegelt. Neben diesen Studien zur allosterischen Kontrolle wurde die physiologische Rolle von DgcZ untersucht, denn dessen primäre Funktion und die Bedingungen, unter denen das Protein aktiv ist, sind nach wie vor nicht ausreichend verstanden. DgcZ-Lokalisationsstudien im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass es bei einer Kombination von Kohlenstoffmangel und alkalischem pH (8,7) zu einer Lokalisation an einem Pol der Bakterienzelle kommt. Diese Lokalisation konnte nur bei sich nicht teilenden Bakterien beobachtet werden und ist bei erneuter Nährstoffgabe reversibel. Auf eine eventuelle Funktion dieses Phänotyps gibt es bis jetzt allerdings keine Hinweise. Des Weiteren wurden Co-Immunpräzipitation-Experimente durchgeführt, in deren Verlauf 11 Proteine identifiziert werden konnten. Unter diesen 11 Proteinen war auch FrdB, eine Untereinheit des Fumarat-Reduktase-Komplexes (FRD), für die anschließend eine Interaktion mit DgcZ mittels eines bakteriellen Zwei-Hybrid-System bestätigt werden konnte. Darüber hinaus erwies sich der FRD-Komplex als essenziell in einer Superoxid-stimulierten Zunahme von DgcZ abhängigen Biofilmen, was auf eine neue Rolle dieses Komplex einerseits und von oxidativem Stress andererseits in der DgcZ-abhängigen Biofilm-Bildung hindeutet. Abschließend wurde die Rolle von DgcZ in der durch CpxAR vermittelten Oberflächenadhäsion untersucht, denn es war bekannt, dass dgcZ durch dieses Zweikomponentensystem transkriptionell reguliert wird. Der Cpx-Komplex wiederum ist für die Oberflächendetektion verantwortlich und stimuliert die Zelladhäsion durch einen bislang unbekannten Mechanismus. Diese Arbeit zeigt nun eine Beteiligung von DgcZ in der Cpx-vermittelten Oberflächenadhäsion und belegt damit eine physiologische Funktion dieser Diguanylat-Zyklase im Übergang von Oberflächendetektion zur Adhäsion. 2016-09-27 opus:6924 Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) is a widespread second messenger regulating several processes including bacterial motility, biofilm formation, and virulence. The enzymes responsible for c-di-GMP production and degradation, diguanylate cyclases (DGCs) and phosphodiesterases (PDEs), respectively, are abundant and often present in multiple copies within bacterial genomes. DGCs possess a characteristic GGDEF domain, whereas PDEs have either an EAL or an HD-GYP domain. In the Escherichia coli K-12 strain MG1655, 29 proteins containing GGDEF and/or EAL domains have been identified. In E. coli, the diguanylate cyclase DgcZ (formerly YdeH) is the major DGC controlling the production of the exopolysaccharide poly-N-Acetylglucosamine (poly-GlcNAc, PGA), which is involved in biofilm formation. DgcZ contains a GGDEF domain, responsible for c-di-GMP production, and a sensory domain. First identified in the chemoreceptor TlpD of Helicobacter pylori, this domain was named chemoreceptor zinc-binding (CZB) domain after its capability to bind zinc. Researchers from the University of Basel’s Biozentrum solved the three-dimensional structure of the DgcZ protein and indeed found a zinc ion bound to the 3His/1Cys motif of the CZB domain. Additionally, zinc was shown to inhibit the activity of DgcZ in vitro with a subfemtomolar constant Ki. This study investigates the regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ in E. coli. To ascertain the role of zinc in the function of DgcZ activity in vivo, site-directed mutagenesis was employed to construct dgcZ alleles encoding protein variants with amino acid exchanges in the CZB domain involved in zinc coordination, thus reducing or abolishing binding. The activity of these DgcZ variants was derived by measuring the levels of PgaD, an enzyme involved in exopolysaccharide production, and of the exopolysaccharide poly-GlcNAc (PGA) produced, both proportional to DgcZ-derived c-di-GMP. Although single exchanges of zinc binding amino acids did not strongly affect the protein activity, a DgcZ variant carrying two such exchanges (H79L and H83L) displayed a significant increase of protein activity. The influence of zinc ions on DgcZ activity was further tested by applying increasing concentrations of ZnSO4 and measuring the ability of bacteria to form a PGA biofilm. Externally applied zinc inhibited PGA biofilm formation in a DgcZ- and c-di-GMP-dependent fashion. The evidence obtained in vivo therefore confirms the results from the in vitro experiments showing that the diguanylate cyclase DgcZ is allosterically regulated by zinc. The relevance of this regulatory mechanism is still unsettled, but potential explanations are that it might help the bacteria discriminate among different niches, characterized by high or low levels of zinc, or that it could “signal” the cell´s own physiological condition. Following these studies on allosteric regulation, the physiological role of DgcZ was examined, as its primary function and the conditions in which the protein is active are still not well defined. Analyses of DgcZ protein localization performed in this study revealed that a combination of carbon starvation and alkaline pH (8.7) induces localization at one bacterial cell pole. Polar localization occurred in non-dividing bacteria and disappeared after restoring nutrient-sufficient conditions. The role of this localization phenotype until now remains elusive. Further, Co-Immunoprecipitation analyses were performed and 11 proteins identified with a significant score. Among these, FrdB, a subunit of the fumarate reductase complex (FRD), interacted with DgcZ within a bacterial two-hybrid system. The FRD complex proved essential in the superoxide-stimulated increase of DgcZ-dependent biofilm, suggesting new roles of this complex and oxidative stress in DgcZ-mediated biofilm formation. Finally, the role of DgcZ in CpxAR-mediated surface adhesion was investigated, as it had already been established that dgcZ is transcriptionally regulated by this two-component system. The Cpx complex in turn had been shown to be responsible for surface sensing and to stimulate bacterial adhesion through an up to now unknown mechanism. This work reveals an involvement of DgcZ in Cpx-mediated surface adhesion, providing evidence for a physiological function of this diguanylate cyclase in connecting the processes of surface sensing and surface attachment. Philipps-Universität Marburg Lacanna, Egidio Lacanna Egidio ths Prof. Dr. Becker Anke Becker, Anke (Prof. Dr.)
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