Biochemical investigations on bacterial and fungal dimethylallyltryptophan synthases

Prenyl transfer reactions occur ubiquitously in nature and play an important role in primary and secondary metabolism in all domains of life. Prenylated secondary metabolites including indole alkaloids usually demonstrate improved biological and pharmacological activities and thus makes them to prom...

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Main Author: Winkelblech, Julia
Contributors: Li, Shu-Ming (Prof.Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2016
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Prenylierungsreaktionen sind in der Natur weit verbreitet und spielen eine wichtige Rolle in dem Primär- und Sekundärmetabolismus aller Lebensformen. Prenylierte Sekundärmetabolite einschließlich Indolalkaloide weisen häufig eine verstärkte biologische und pharmakologische Aktivität auf, wodurch sie vielversprechende Kandidaten für die Arzneistoff-Findung und Entwicklung darstellen. Wichtige Produzenten solcher bioaktiver Substanzen sind Pilze der Askomyzeten und Bakterien der Aktinomyzeten. Die Übertragung eines Prenylrestes meistens von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), auf Indolderivate mitunter Tryptophan werden in der Natur durch Enzyme der Dimethylallyltryptophan-Synthase (DMATS)-Superfamilie katalysiert. Bemerkenswerte Fortschritte wurden in den letzten Jahren in der biochemischen, molekularbiologischen und strukturellen Charakterisierung dieser Enzyme, insbesondere solcher aus Pilzen, erzielt. Die größte Herausforderung dieser Arbeit besteht darin, ein besseres Verständnis über die katalytischen Eigenschaften dieser Enzyme unterschiedlicher Herkunft zu erlangen. Die Klonierung, Expression und die anschließenden biochemischen Untersuchungen drei neuer Tryptophan-Prenyltransferasen offenbarten neue, interessante Eigenschaften. Zunächst wurden mit 6-DMATSSa aus Streptomyces ambofaciens und 6-DMATSSv aus Streptomyces violaceusniger zwei Tryptophan-C6-Prenyltransferasen identifiziert. Die biochemischen Untersuchungen dieser Enzyme ergaben eine breite Substratspezifität. Neben einer Vielzahl an Indolderivaten wurden auch mehrere Hydroxynaphthaline von 6-DMATSSa und 6-DMATSSv akzeptiert. Zudem handelt es sich um die erstmalige Beschreibung für Tryptophan-Prenyltransferasen, die sowohl DMAPP als auch GPP als Prenyldonor akzeptieren und die Prenylierung an derselben Position katalysieren. Folglich stellen die untersuchten 6-DMATS Enzyme interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen bezüglich der Akzeptanz von unnatürlichen Alkyl- oder Benzyldonoren dar. Bisherige Studien zu diesem Thema beschränken sich auf die pilzlichen C4- und C5-Prenyltransferasen. Im Rahmen dieses Projektes wurden daher die L-Tyrosin-Prenyltransferase TyrPT mit Tryptophan-C7-Prenyltransferase Aktivität, zwei 6-DMATS sowie die bakterielle 5-DMATSSc (SCO7467) analysiert. Hierzu wurde das Verhalten der C5-, C6- und C7-Prenytransferasen in Gegenwart der unnatürlichen Prenyldonoren Methylallyl- (MAPP), 2-Pentenyl (2-Pentenyl-PP) oder Benzyldiphosphat (Benzyl-PP) untersucht. Diese DMAPP-Analoga wurden von allen getesteten Enzymen mit unterschiedlichen, relativen Aktivitäten und Regioselektivitäten akzeptiert. C6-alkylierte/benzylierte Derivate wurden in allen Reaktionen identifiziert, entweder als einzelnes Produkt der beiden 6-DMATS oder als eines der Hauptprodukte der anderen Enzyme. Diese Ergebnisse weisen auf eine deutliche Präferenz der fünf Enzyme für die Alkylierung/Benzylierung an C-6 des Indolrings in Gegenwart der unnatürlichen DMAPP-Derivate hin. Des Weiteren führte das „homology modeling“ der 5-DMATS und anschließende „docking“- sowie „molecular dynamics“-Studien mit DMAPP, MAPP und 2-Pentenyl-PP zu einer distanzbasierten Erklärung für die beobachteten Reaktionsergebnisse. Später wurde mit 6-DMATSMo aus Micromonospora olivasterospora eine dritte Tryptophan-C6-Prenyltransferase identifiziert und charakterisiert. Das auffälligste Merkmal der 6-DMATSMo ist die hohe relative Aktivität gegenüber D-Tryptophan. Dieses Resultat führte zu der vergleichenden Studie über die Enantioselektivität von sieben DMATS-Enzymen aus Pilzen und Bakterien. Für die verschiedenen Prenyltransferasen wurden unterschiedliche Substratpräferenzen sowie eine unterschiedliche Regioselektivität bezüglich der L- und D-Enantiomere von Tryptophan und deren methylierten Derivaten festgestellt. Interessanterweise bevorzugten die bakteriellen 5-DMATSSc und 6-DMATSMo das D-Enantiomer von 5-Methyltryptophan gegenüber dem L-Enantiomer, was in allen anderen Reaktionen das bessere Substrat darstellte. In Gegenwart des Racemats, führt die hohe Affinität zur L-Form zur Hemmung der D-Enantiomer-Reaktion. Weiterhin konnte eine reduzierte oder sogar grundlegend veränderte Regioselektivität der Reaktion von FgaPT2, 5-DMATSSc und 7-DMATS mit dem D-Enantiomer von Tryptophan und 5-Methyltryptophan beobachtet werden. Außerdem konnte mit 5-DMATSSc erstmals eine Tryptophan-Prenyltransferase beschrieben werden, die eine Diprenylierung in einem sukzessiven Reaktionsmechanismus katalysiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Identifizierung und Charakterisierung drei neuer 6-DMATS aus Aktinomyzeten zu einem besseren Verständnis bakterieller Tryptophan-Prenyltransferasen führen. Auf Grund der besonderen Eigenschaften untersuchter Prenyltransferasen ergibt sich schließlich die Möglichkeit, mittels neuer Biokatalysatoren das Repertoire alkylierter, potenziell aktiver Substanzen zu erweitern.