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Design, Synthese und Evaluation von Inhibitoren der bakteriellen RNase P und der Dengue-Virus-Protease
Das Auffinden neuer Targets und Wirkstoffe, um bakterielle und virale Infektionen auch in Zukunft behandeln zu können, ist ein zentraler Bestandteil der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte ausgehend von einem Screeninghit, der ein Inhibitor der bakteriellen R...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2016
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Das Auffinden neuer Targets und Wirkstoffe, um bakterielle und virale Infektionen auch in Zukunft behandeln zu können, ist ein zentraler Bestandteil der Bekämpfung von Infektionskrankheiten.
Im ersten Teil dieser Arbeit konnte ausgehend von einem Screeninghit, der ein Inhibitor der bakteriellen RNase P ist, eine Syntheseroute entwickelt werden, die nicht nur das Bereitstellen des Screeninghits in größeren Mengen, sondern auch eine einfache Variation der Substituenten des Screeninghits erlaubte. Mit Hilfe dieser Synthese konnten Verbindungen hergestellt werden, die besser löslich und aktiver im in vitro Assay waren und im Agar-Diffusionstest einen größeren Hemmhof als der initiale Screeninghit aufwiesen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit, der das de novo Design von Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease zum Ziel hatte, wurden Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease dargestellt, deren Grundstruktur sich von den bisher publizierten Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease unterscheidet. Aufgrund einer wenig ausgeprägten SAR der synthetisierten Inhibitoren galt es zunächst, eine unspezifische Inhibition der Dengue-Virus-Protease durch die erhaltenen Inhibitoren auszuschließen. Eine spezifische Inhibition der Dengue-Virus-Protease durch die synthetisierten Inhibitoren konnte schließlich durch eine Verbesserung der Löslichkeit des Inhibitors im verwendeten Fluoreszenz-basierten Inhibitionsassay und durch Anwendung der dynamischen Lichtstreuung nachgewiesen werden. Die Verbesserung der Löslichkeit wurde durch ein Steigern des DMSO-Anteils im Assay erreicht. Der gesteigerte Anteil an DMSO im Fluoreszenz-basierten Inhibitionsassay ließ sich auch auf den verwendeten Thermal-Shift-Assay und das Soaking von Kristallen der Dengue-Virus-Protease übertragen. Sowohl im Thermal-Shift-Assay, als auch beim Soaking von DV3pro Kristallen konnte der DMSO-Anteil auf über 30% gesteigert werden. Dieser sehr hohe DMSO-Gehalt ermöglicht es, weniger potente oder schlecht lösliche Inhibitoren in hohen Konzentrationen auf eine Inhibition der Dengue-Virus-Protease zu testen und so mögliche Ausgangspunkte für ein weiteres Design von Inhibitoren zu erhalten.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde schließlich der Effekt des nicht-ionischen Detergenzes Triton X-100, welches Aggregate aufbrechen und damit unspezifische Inhibition verhindern soll, untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die bei dem Test von spezifischen Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease beobachteten Effekte von Triton X-100 auch bei weiteren Proteasen und Assaysystemen auftreten. Zunächst konnte durch Verwenden von Pepstatin A, einem peptidischen und kompetitiven Inhibitor von Aspartylproteasen, gezeigt werden, dass Triton X-100 nicht das gesamte Assaysystem beeinflusst, da das Inhibitionsverhalten von Pepstatin A gegen die HIV-1-Protease und Endothiapepsin nicht beeinflusst wurde. Durch das Testen von strukturell unterschiedlichen Inhibitoren der HIV-1-Protease und Endothiapepsin konnte nachgewiesen werden, dass Triton X-100 bestimmte Inhibitoren beeinflusst, andere strukturell verwandte Inhibitoren aber nicht in ihrem Inhibitionsverhalten gegenüber der Protease gestört werden. Da in Screenings, in denen Inhibitoren unter Verwendung von Triton X-100 als Detergenz keine Inhibition mehr zeigen, davon ausgegangen wird, dass deren Inhibition nicht spezifisch ist, also durch Aggregate verursacht wird,118 führt der beobachtete Inhibitionsabfall der spezifischen Aspartylproteasen-Inhibitoren unter Triton X-100 zu falsch-negativen Hits in diesen Screenings. Um solche falsch-negativen Hits zu vermeiden, konnte gezeigt werden, dass alternativ in Dengue-Protease-, HIV-1-Protease- und Endothoapepsin-Assays das Detergenz CHAPS eingesetzt werden kann, da dieses Detergenz im vorliegenden Fall keine falsch-negativen Hits generiert.
Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit Inhibitoren durch die unterschiedlichen Methoden der medizinischen Chemie von sowohl bakteriellen als auch viralen Krankheitserregern gefunden und optimiert werden. Der DMSO-Gehalt der bei der Suche nach Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease verwendeten Assaysysteme konnte deutlich gesteigert werden und es konnte nachgewiesen werden, dass Triton X-100 Inhibitoren beeinflussen kann und es daher nicht das optimale Detergenz für Screening-Kampagnen darstellt. Unter Berücksichtigung der in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse können Inhibitoren der RNase P und der Dengue-Virus-Protease entworfen und weiter optimiert werden und dank der Aussagen über die Verwendung Triton X-100 in Screening-Kampagnen lässt sich in Zukunft die Anzahl von potentiellen Ausgangspunkten für eine weitere Strukturoptimierung möglicherweise deutlich erhöhen. |
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| Umfang: | 219 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2016.0674 |