Dynamics of DNA repair enzymes and competence proteins in Bacillus subtilis

DNA Doppelstrangbrüche (DSBs) sind eine schwere Bedrohung der Integrität des Genoms, deshalb gibt es seine Vielzahl von Proteinen, die solche Schäden reparieren. Der in Bakterien wichtigste Signalweg ist die homologe Rekombination (HR), mit der ATPase RecA als zentrales Enzym. RecA bildet dabei Filamente, die die Distanz zwischen den beiden Schwesterchromatiden überbrückt. Aber bereits vor RecA gibt es eine Vielzahl von Proteinen (RecNJORFX), die aktiv bei HR werden. In Bacillus subtilis startet dieser Prozess damit, dass RecN Fokusse bildet, 15 Minuten nachdem DSBs induziert werden. Beendet wird der Vorgang 3 Stunden später durch den Abbau der RecA-Filamente und der Wiederaufnahme des Wachstums. Ich wollte einen detailreicheren Einblick in die Dynamik der beteiligten Proteine haben und habe deshalb die Methode der Einzelmolekülmikroskopie (single molecule microscopy) in lebenden Zellen angewandt. Dabei habe ich Videos mit 40 ms Belichtungszeit erstellt, die Bewegung der Rec-Proteine gemessen und die resultierenden Trajektorien mathematisch analysiert. In exponentiell wachenden Zellen konnte ich beobachten, dass RecN, RecO und viele RecJ-Moleküle kontinuierlich das Chromosom abrastern, was ein Model für die Einzelmoleküle der distributiven Suche unterstützt. Im Gegensatz zu RecN und RecO verbleibt ein Anteil der RecJ-Moleküle an der Replikationmaschine. Sobald DSBs induziert werden, verharren RecNOJ an mehreren Stellen auf dem Nukleoid. RecN bildet keine statischen Reparaturzentren, wie man in Eukaryoten beobachten konnte, sondern kurzlebige (~2,5 s) Cluster die als Rekrutierungsplattform für Reparaturenzym dienen. So wird die lokale Konzentration von Rec-Proteinen erhöht und das Einfangen von Interaktionspartnern aus einem diffusen Reservoir ermöglicht. Der Großteil der RecNJO-Moleküle sucht, selbst in Gegenwart von DSBs, weiterhin das Chromosom nach Schäden bzw. Interaktionspartnern ab. In toto zeigt meine Arbeit, dass die initiale Detektion von DSBs, das Prozessieren der freien DNA-Enden und das Beladen der hergestellten ssDNA mit RecA in sehr kurzen Zeiträumen abläuft und nur von einer Minderheit der Proteinpopulation bewerkstelligt wird.