Das DegS-DegU Zwei-Komponenten System und dessen Rolle bei der Regulation des osmotisch induzierbaren yqiHIK Operons aus Bacillus subtilis

Die Verfügbarkeit von Wasser ist essentiell für die Entwicklung von lebenden Zellen. In den obersten Bodenschichten, dem natürlichen Lebensraum des Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, ist dieser diversen Stressfaktoren ausgesetzt, die die Verfügbarkeit von...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Löbach, Stephanie
Beteiligte: Bremer, Erhard (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2016
Biologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2016.0099
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die Verfügbarkeit von Wasser ist essentiell für die Entwicklung von lebenden Zellen. In den obersten Bodenschichten, dem natürlichen Lebensraum des Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, ist dieser diversen Stressfaktoren ausgesetzt, die die Verfügbarkeit von Wasser beeinflussen. Trockenperioden führen zu einem hyperosmotischen Stress für die Zelle, der letztendlich die Plasmolyse der Zelle zur Folge haben könnte. Um diesen Wasserverlust zu vermeiden, ist B. subtilis in der Lage durch Synthese oder Transport kompatible Solute zu akkumulieren und sich dadurch vor den negativen Auswirkungen hoher Osmolarität/Salinität zu schützen. In Hinblick auf die zelluläre Osmoadaptation konnte aber bisher noch nicht geklärt werden wie B. subtilis Osmostress wahrnimmt. Die Stresswahrnehmung in Bakterien erfolgt oftmals über Zwei-Komponenten Systeme (TCS). In Transkriptomanalysen hyperosmotisch gestresster B. subtilis Kulturen wurde das DegS-DegU TCS als einziges salzinduzierbares System identifiziert (299). Dieses System kontrolliert eine Vielzahl von Prozessen die charakteristisch für die Übergangsphase von der exponentiellen zur stationären Phase und während zellulärer Differenzierungswege sind. Das DegS-DegU TCS konnte zwar schon als salzinduziert identifiziert werden, aber wie genau es auf osmotischen Stress reagiert konnte nicht geklärt werden. Im Verlauf meiner Promotion konnte ich mittels Reportergenanalysen die Salzinduktion des degSU Genclusters nachweisen. Weiterhin konnte ein positiver Feedback Loop von DegU~P auf den eigenen Promotor (degUP3) erstmals unter Salzstress nachgewiesen werden. Außerdem zeigte sich, dass die Expression des degUP3 Promotors nur bei hohen Salzkonzentrationen (≥ 0,8 M NaCl) erfolgt. Das DegS-DegU TCS wird durch zwei Proteine (RapG und PhrG) reguliert (236), die in dieser Studie durch Reportergenanalysen ebenfalls als salzinduziert identifiziert wurden. Die phänotypische Charakterisierung zeigte, dass die Deletion des DegS-DegU TCS unter hyperosmotischen Bedingungen zu einer geringen Verlängerung der Lag-Phase von B. subtilis Kulturen führt. Interessanterweise führte die Hyperphosphorylierung von DegU zu einem stark verbesserten Wachstum, sowohl unter isoosmotischen als auch unter hyperosmotischen Bedingungen. Dieser Phänotyp konnte nicht auf die Akkumulation des de novo synthetisierten kompatiblen Soluts Prolin zurückgeführt werden. Um eine mögliche Beteiligung von DegS-DegU in der Adaptation an hochsaline Bedingungen zu studieren, wurden die Gene, die DegU~P reguliert, in Hinblick auf ihre Salzinduktion charakterisiert. Dabei kristallisierte sich heraus, dass die Hälfte des DegU~P Regulons (197) salzinduzierbar ist, jedoch die Salzinduktion unabhängig von DegS-DegU ist. Dies zeigte sich durch Reportergenstudien der Gene aus dem Überlapp des DegU~P Regulons und des Salz-Modulons, die trotz einer Deletion des DegS-DegU TCS immer noch salzinduzierbar waren. In diesem Zusammenhang wurde das vor kurzem identifizierte Typ VII Sekretionssystem (T7SS, yukE-yueD) detaillierter analysiert. Die Deletion des T7SS führte unter hyperosmotischen Bedingungen im B. subtilis 168 Laborstamm zu keinem Phänotyp. Es zeigte sich aber, dass dessen Expression salzinduzierbar ist und durch das DegS-DegU TCS reguliert wird. Reportergenanalysen deckten auf, dass DegU~P unter pyhsiologischen Bedingungen als Aktivator und unter hyperosmotischen Bedingungen möglicherweise als Repressor agiert. Weiterhin wurde eine Beteiligung der Biofilmregulatoren SinR, ein Repressor, und RemA, ein Aktivator, nachgewiesen. Der Schwerpunkt meiner Arbeit fokussierte sich auf die Analyse der Regulation des osmotisch induzierbaren yqiHIK Operons und dessen Regulation durch das DegS-DegU Zwei-Komponenten System. Das yqiHIK Operon, welches in verschiedenen Transkriptomstudien (172, 230, 299) als stark salzinduzierbar identifiziert wurde, steht ebenfalls unter der Kontrolle des DegS-DegU TCS (86). Reportergenanalysen und ein Northern Blot zeigten, dass das Operon als eine Einheit transkribiert wird und diese salzinduzierbar ist. Weiterhin wiesen diese Analysen darauf hin, dass DegU~P in diesem Fall als Aktivator fungiert. Durch Verkürzungen einer stromaufwärts gelegenen AT-reichen Region und der gerichteten Mutagenese putativer DegU~P Bindestellen, konnte eine Bindestelle von DegU~P in einem Abstand von 203 bp zum Transkriptionsstart identifiziert werden. Durch Western Blot Analysen konnte die N-Acetylmuramyl–L-Alanin Amidase YqiI im extrazellulären Bereich lokalisiert werden und die Glycerophosphodiester Phosphodiesterase YqiK im Zytoplasma. Dies erlaubte eine neue Beschreibung der physiologischen Funktion der von yqiHIK kodierten Proteine. Die Eigenschaften des yqiHIK Promotors wurden außerdem als Hilfsmittel genutzt um die Rolle von DegS-DegU während der Osmoadaptation näher zu charakterisieren. Durch Mutationen im SigA-abhängigen Promotor von yqiHIK, die das Expressionsniveau verbessern, konnte dieser trotzdem durch Salzstress induziert werden, obwohl das DegS-DegU TCS deletiert wurde. Eine synthetisch hergestellte membrangebundene Kinase (KinC-DegS) führte ebenfalls zu einer Salzinduktion von yqiHIK, obwohl diese Hybridkinase nicht auf ein osmotisches Signal reagiert (193). Entgegen eines zuvor gemachten Vorschlags (279) konnte also in dieser Dissertation gezeigt werden, dass DegS nicht der global-agierende Salzsensor in B. subtilis ist. Das DegS-DegU System trägt aber zur Transkriptionskontrolle einer Vielzahl von Salzstress-regulierten Genen von B. subtilis bei.
DOI:http://dx.doi.org/10.17192/z2016.0099