The Ustilago maydis MAP kinase signaling pathway: Identification of MAP kinase targets by phospho-peptide enrichment

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands und dient als Modellorganismus um Interaktionen zwischen Pilz und Pflanze zu untersuchen. Pilzliche Paarung, invasives Wachstum in Maispflanzen und Virulenz werden in U. maydis über eine MAP-Kinase(MAPK) Kaskade reguliert. Zentrale Faktoren für Pathogenität sind die konservierten MAP-Kinasen (MAPKs) Kpp2 und Kpp6. Die MAP-Kinase Kpp2 ist in den Prozess der Appressorienbildung involviert, wohingegen Kpp6 eine Rolle während der Penetration pflanzlicher Epidermiszellen spielt. Weder für Kpp2 noch für Kpp6 wurden bisher die Substratproteine identifiziert welcher direkt phosphoryliert werden. Ziel dieser Arbeit war es wichtige Virulenzfaktoren zu identifizieren, welche in der MAP-Kinase Kaskade direkt unterhalb von Kpp2 und Kpp6 agieren. Zur artifiziellen Induktion der MAP-Kinase Kaskade wurde der Stamm FB1fuz7DD genutzt, welcher ein konstitutiv aktives allel der MAP-Kinase-Kinase Fuz7 (Fuz7DD) unter Kontrolle eines Arabinose induzierbaren Promotors exprimiert. Mittels eines phosphoproteomischen Ansatzes konnten nach Induktion der MAP-Kinase Kaskade phosphorylierte Proteine in Anwesenheit und Abwesenheit von kpp2 und kpp6 detektiert werden. Anreicherung phosphorylierter Proteine erfolgte in einem zweistufigen chromatographischen Prozess, bei welchem zunächst mittels einer Al(OH)3 Metalloxid Affinitätschromatographie (MOAC) Phosphoproteine angereichert wurden, um nach tryptischer Hydrolyse, mittels TiO2 MOAC Phosphopeptide zu isolieren. LC-MS/MS Analyse der Phosphopeptid Fraktion ergab 111 potentielle MAP-Kinase Substrate, welche in den Stämmen FB1fuz7DD und FB1Δkpp6Δkpp2fuz7DD differenziell phosphoryliert vorlagen. Fünfzehn dieser differenziell phosphorylierten Proteine, welche möglicherweise direkte Substrate von Kpp2 und Kpp6 sind, wurden nach umfassender bioinformatischer Analyse ausgewählt und weiter untersucht. Um zu prüfen ob diese Gene möglicherweise zu pilzlicher Paarung oder Virulenz beitragen wurden die entsprechenden Gene in einem solopathogenen Stamm, z.T auch in kompatiblen wiltyp Stämmen, deletiert. Analyse der entsprechenden Deletionsstämme zeigte, dass um12335 für Virulenz benötigt wird. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass es III sich bei Um12235 möglicherweise um ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein handelt, welches ein direktes Substrat der MAP-Kinasen Kpp2 und/ oder Kpp6 ist.