Characterization of a type I-B CRISPR-Cas system of Clostridium thermocellum

CRISPR-Cas Systeme stellen adaptive Abwehrsysteme dar, die in Bakterien und Archaeen gefunden werden und vererbbare Resistenz gegen mobile genetische Elemente wie z.B. Viren und Plasmide vermitteln. CRISPR-Cas Systeme bestehen aus einem oder mehreren CRISPR-Loci und assoziierten cas Genen. CRISPR-Loci enthalten virale DNA-Sequenzen (Spacer) die durch identische, repetitive Sequenzen (Repeats) getrennt werden. Cas-Proteine bilden Ribonukleoproteinkomplexe (RNP-Komplexe) mit kleinen CRISPR RNAs (crRNAs), die als Zielerkennungsmoleküle Nukleinsäuren detektieren und zum Verdau markieren. Die Einführung einer Nomenklatur zur Klassifizierung der Cas-Proteine verdeutlicht die Diversität von CRISPR-Cas Systemen, die durch die Co-Evolution von Phage und Wirt angetrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Typ I-B CRISPR-Cas System des thermophilen Bakteriums Clostridium thermocellum untersucht. CRISPR-Loci werden in Precursor-crRNAs transkribiert und anschließend von Cas6 Endonukleasen zu individuellen crRNAs prozessiert. C. thermocellum enthält zwei Cas6 Proteine, die als rekombinante Enzyme in vitro ausschließlich die ihnen zugehörigen Precursor-Transkripte schneiden. RNA-Seq-Analysen bestätigten die Produktion von crRNAs und belegten variable Transkriptmengen individueller crRNAs in vivo. Es konnten Promotoren innerhalb von CRISPR-Loci beobachtet werden. Des Weiteren wurden entgegengesetzte crRNA-Transkripte (Anti-crRNAs) identifiziert, die ein deutliches Prozessierungsmuster aufweisen. Die Transkriptmenge der komplementären crRNAs ist häufig reduziert. Aktivitätsassays mit doppelsträngigen crRNA/Anti-crRNA-Hybriden zeigten, dass RNase III imstande ist, Anti-crRNAs zu schneiden. Diese Aktivität wird durch Erkennungsmotive in der Sequenz von Repeat-RNA-Hybriden vermittelt. Typ I-B CRISPR Interferenz wird durch crRNP-Komplexe vermittelt, die doppelsträngige Fremd-DNA erkennen und als Cascade-Komplexe bezeichnet werden. Diese Cascade-Komplexe setzten sich aus den Cas-Proteinen Cas3, Cas5, Cas6, Cas7 und der Subtyp-spezifischen Untereinheit Cas8b zusammen. Alle fünf rekombinanten Cascade-Untereinheiten wurden in Escherichia coli hergestellt. In vitro-Studien zur Assemblierung von rekombinanten Cascade-Komplexen zeigten, dass Cas5, Cas7, Cas8b und crRNA stabile Untereinheiten sind. Cas3 ist kein fester Bestandteil des Komplexes und Cas6 interagiert nur zeitweise mit anderen Cas-Komponenten. Massenspektrometrische Analysen belegten die Interaktion zwischen Cas5, Cas7 und Cas8b, und ermittelten eine ungerade Komplexstöchiometrie von 1:1:6:2,5 für Cas5:Cas6:Cas7:Cas8b. Die große Untereinheit Cas8b weist ein zusätzliches C-terminales Proteinfragment auf, welches im Zellextrakt von C. thermocellum nachgewiesen wurde und ebenfalls mit dem Cascade-Komplex assembliert. Die Ergebnisse dieser Studie ermöglichen einen Einblick in die Assemblierung der einzelnen Cas-Proteine zu einem Typ I-B Cascade in vitro. Des Weiteren verdeutlichen RNA-Seq Analysen der CRISPR-Arrays den Einfluss von individuellen Spacer-und-Repeat-Sequenzen auf die Funktionalität von CRISPR-Cas Systemen.