Adenylyl cyclase 5/6 underlie PIP3 dependent regulation

A wide variety of signaling substances such as hormones, neurotransmitters, odorants and chemokines control intracellular signaling by regulating the production of the second messenger cAMP. By activating Epac, PKA and cyclic nucleotide-gated ion channels, the production of cAMP alters a wide range...

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Main Author: Gopireddy, Raghavender Reddy
Contributors: Bünemann, Moritz (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2015
Pharmazie
Subjects:
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Table of Contents: Eine große Bandbreite von Signalmolekülen _ darunter Hormone, Neurotransmitter, Geruchsstoffe und Chemokine _ kontrollieren intrazelluläre Signale durch die Regulation des sog. zweiten Botenstoffs cAMP. Die Produktion von cAMP beeinflusst verschiedenste biologische Prozesse wie die Zellteilung und Stoffwechsel. Dies geschieht unter anderem durch die Aktivierung von Epac, PKA und cyclisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle. Eine Reihe von GPCR kontrolliert das intrazelluläre cAMP-Niveau mittels des Einflusses von stimulatorischen oder inhibitorischen G-Proteinen auf die Adenylylcyclasen. Die Aktivität der weit verbreiteten AC5 und AC6 wird durch stimulatorische G-Proteine (Gαs) erhöht, während sie durch inhibitorische G-Proteine (Gαi) verringert wird. Mechanistisch werden Inhibition und Stimulation durch direkte Protein/Protein-Interaktionen vermittelt. Zusätzlich zu dieser direkten Regulation wurde in anderen vorangegangenen Studien eine cAMPRebound-Stimulation beschrieben. Diese trat in Kardiomyocyten auf, sobald die Aktivierung von Gi-Proteinen beendet wurde. Der zugrundeliegende Mechanismus ist umstritten (Hartzell, 1988; Wang et al., 1995). Ein ähnliches cAMP-Rebound-Verhalten wurde auch bereits in unserem Labor in HEK293T-Zellen beobachtet, nachdem die Stimulation α2Aadrenerger Rezeptoren beendet wurde (Milde et al., 2013). Daher zielte die vorliegende Arbeit auf die Untersuchung des zugrundeliegenden Mechanismus dieses Gi-Proteininduzierten cAMP-Rebound-Effekts. Es wurden viele genetisch kodierte Biosensoren entwickelt, die auf dem Förster/Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) beruhen und mit denen die zeitliche und räumliche Dynamik von verschiedenen intrazellulären Signalen, einschließlich denen der zweiten Botenstoffe, sichtbar gemacht werden konnte. Der FRET-basierte cAMP-Biosensor Epac1-camps wurde zusammen mit heterologen Überexpressionsmodellen benutzt, um den Mechanismus der Gi-Protein-vermittelten cAMP-Rebound-Stimulation in Kardiomyocyten und anderen lebenden Zellen zu untersuchen. Während der Untersuchung dieses wohlbekannten cAMP-Rebound Phänomens beobachteten wir einen PTX-empfindlichen, Gi-Protein-vermittelten Typ5/6-Adenylylcyclase/cAMP-abhängigen Signalweg. Zusätzlich dazu stellten wir fest, dass die Inhibition von Gβγ-Untereinheiten durch Gallein zu einer Verringerung der AC5-vermittelten cAMP-Rebound-Antwort führte, während die Überexpression von AC4 keine zusätzliche Stimulation von cAMP bewirkte. Dies legt nahe,dass verschiedene Gβγ-vermittelte Signalwege existieren. Bemerkenswerterweise beobachteten wir auch, dass, PI3K den AC5/6-abhängigen cAMP-Rebound-Effekt abschwächte. Dies deutete darauf hin, dass die Gi-vermittelte cAMP-Rebound-Antwort einem PI3K-abhängigen Signalweg unterliegt. Tatsächlich bestätigte die Überexpression der PIP3-spezifischen Phosphatase PTEN, dass PIP3 selbst, entweder direkt oder indirekt, die Gi-abhängige cAMP-Rebound-Antwort vermittelt. Der Einfluss von PIP3 auf die cAMP Rebound-Niveaus wurde zusätzlich durch die Inhibition der PIP2-spezifischen Phosphatase SHIP und weiterer Vorgänge unterhalb der PIP3-abhängigen Regulation von Akt bestätigt. Außerdem konnte der Signalweg verstärkt werden, wenn die Gi-abhängige PI3K-Aktivierung durch die Stimulation des PDGF-Rezeptors umgangen wurde. Zusätzlich dazu konnten wir bestätigen, dass auch in atrialen Myocyten die Inhibierung der PI3K die Ausbildung der cAMP-Rebound-Antwort verhinderte, nachdem Acetylcholin entfernt wurde. Wir vermuten, dass diese neu beschriebene PIP3-abhängige Regulation der AC5/6 jenen unbekannten Mechanismus darstellt, der physiologischen Phänomenen wie der post-vagalen Tachikardie zu Grunde liegt.