Biochemical investigations on bacterial and fungal prenyltransferases

Prenylierte Substanzen sind in der Natur weitverbreitet und weiseneine erstaunliche strukturelle Diversitätauf. Sie besitzen häufigeine vielversprechende biologische Aktivität, was sie von ihren unprenylierten Vorstufenunterscheidet. Daher werden sie von Wissenschaftlern aus verschiedenen Diszipline...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Fan, Aili
Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2015
Pharmazeutische Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Prenylierte Substanzen sind in der Natur weitverbreitet und weiseneine erstaunliche strukturelle Diversitätauf. Sie besitzen häufigeine vielversprechende biologische Aktivität, was sie von ihren unprenylierten Vorstufenunterscheidet. Daher werden sie von Wissenschaftlern aus verschiedenen Disziplinen umfangreich untersucht.Die Forschung beinhaltet deren Biosynthese unddie daran beteiligten Schlüsselenzyme, wie z. B. Prenyltransferasen, die maßgeblich an der strukturellen Vielfalt und biologischen Aktivität beteiligt sind. Prenyltransferasen katalysieren die Übertragung einer Prenyleinheit von unterschiedlichen Prenyldonoren auf verschiedene aliphatische oder aromatische Akzeptoren. Diese Dissertation beschäftigt sich mit den Prenyltransferasen der Dimethylallyltryptophansynthase (DMATS) Superfamilie. Die Prenyltransferase TyrPT, ein neues Mitglied dieser Superfamilie, wurde biochemisch in vitro charakterisiert. Das verantwortliche GenAn13g01840 wurde zuvor in der Genomsequenz von A. niger identifiziert und in pET28a kloniert. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, dass TyrPT sowohl die O-Prenylierung von Tyrosin als auch die C7-Prenylierung von Tryptophan katalysiert. Weiterhin wurde dieses Enzym mit der bekannten Tyrosin-O-Prenyltransferase SirD und der Tryptophan-C7 Prenyltransferase 7-DMATS gegenüber einer Reihe von Tyrosin- und Tryptophan-Derivate als Substrate verglichen. TyrPT wies ein breiteres Substratspektrum sowieeine deutlich höhere katalytische Aktivität für verschiedeneSubstrate auf, als die zwei anderen Enzyme. Ebenso wurden die kinetischen Parameter der TyrPT-Reaktionen mitzehn Substraten bestimmt. Diese Arbeitliefert nicht nur ein neues Enzym, sondern vergröβert auch unser Wissen über dieBeziehungenderTyrosin-O- und Tryptophan-C-Prenyltransferasen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Tryptophan-Prenyltransferasen FgaPT2 und 7-DMATS auch Tyrosin und dessen Derivate als Substrate akzeptieren und jeweils eine C3- und O-Prenylierung katalysieren. Ein Mechanismus der FgaPT2-Reaktion mit Tyrosin wurde durchmolekulares modellieren („molecularmodeling“) basierend auf der verfügbaren Kristallstruktur postuliert. Ausgehendvon dieser Hypothese wurden 16 FgaPT2-Mutanten mit Tryptophan und Tyrosine als Substrate getestet. Die Mutante K174F zeigte eine viel höhere katalytische Aktivität gegenüber Tyrosin als FgaPT2, jedoch kaum Aktivität mit Tryptophan. Somit wurde die Tryptophan-C4-Prenyltransferase durch zielgerichtete Mutagenese zu einer spezifische Tyrosin-C3-Prenyltransferase umgewandelt. Diese Strategie wurde auch eingesetzt um diekatalytische Aktivität von FgaPT2 als C4-prenylierendes Enzym von zyklischen Dipeptidenzu erhöhen. 13 FgaPT2-Mutanten mit deutlichhöherer katalytischer Aktivität und unterschiedlichen Substratspräferenzengegenüber Dipeptidenkonntenals neue Biokatalysatoren erhalten werden. Motiviert durch die zuvorgenannten Ergebnisse wurden zwei Analoga von L-Tyrosin, L o- und L-m-Tyrosin, mit den Tryptophan-Prenyltransferasen FgaPT2, 5-DMATS, 6-DMATSSv und 7-DMATS sowie den Tyrosin-Prenyltransferases SirD und TyrPT getestet. Interessanterweise akzeptierte SirDdie zwei Tyrosin Analoga nur gering. Im Gegensatz dazu, wiesen die Tryptophan-Prenyltransferasen eine höhere katalytische Aktivität gegenüber diesen Substraten auf. Durch Produkt-Isolierung und Strukturaufklärung konnte bezüglich TyrPT und den Tryptophan-PrenyltransferasenC5-prenyliertes o-Tyrosin als einzigesProdukt nachgewiesen werden. Für die FgaPT2-Reaktion wurden C4- und C6-prenyliertes m-Tyrosin identifiziert. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass die Grund Strukturder Substrate keine essentielle Rolle für die Akzeptanz von Tryptophan- oder Tyrosin-Prenyltransferasen spielt, sondern von der Substitutionsposition der funktionellen Gruppe am aromatischen Kern abhängt, welche in direkte Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms tritt. Die zuvor beschriebenen Ergebnisse verdeutlichen die breite Substratspezifität der DMATS-Enzyme. Die Tryptophan-Prenyltransferasen akzeptieren jedoch die zyklischenDipeptide nur bei hohen Proteinkonzentrationen. Im Gegenzug stellt Tryptophan ein sehr schlechtes Substrat für zyklische Dipeptid-Prenyltransferasen dar. Die Substratpromiskuität der Indol-Prenyltransferasen, einschließlich der Tryptophan- und tryptophanhaltigenzyklischenDipeptid-Prenyltransferasen wurde durch das unnatürliche Substrat cyclo-L-homotryptophan-D-valin, welches ein zusätzliches C-Atom zwischen denIndol- und Diketopiperazinringen besitzt, erweitert. Alle drei getestetenTryptophan-Prenyltransferasen sowie die fünf zyklischenDipeptid-Prenyltransferasen akzeptierten das Substrat sehr gut. Sieben prenylierte Produkte mitjeweils einer Prenylgruppe an jeder Position des Indolkerns wurden aus den Enzymreaktionen isoliert. Damit wurden erstmals sieben monoprenylierte Produkte aus einem Substrat in einstufigen Reaktionenproduziert. Die aus dieser Dissertation hervorgegangenen Ergebnisse demonstrieren, dass die Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie eine wertvolle Quelle für Biokatalysatoren darstellen unddamit eine wichtige Rolle in der Produktionprenylierter Verbindungen spielen könnten.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2015.0371