Die zeitliche Stabilität und zelluläre Lokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen wird durch die Rezeptorphosphorylierung determiniert.

Die Phosphorylierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle für die Interaktion mit Arrestinen und die Rezeptordesensibilisierung. Es ist jedoch unklar, wie unterschiedliche Phosphorylierungsmuster die Interaktion von Arrestin mit Rezeptoren und den nachfolgende Transportmuste...

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Main Author: Zindel, Diana
Contributors: Brünemann, Moritz (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2015
Pharmakologie und Toxikologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die Phosphorylierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle für die Interaktion mit Arrestinen und die Rezeptordesensibilisierung. Es ist jedoch unklar, wie unterschiedliche Phosphorylierungsmuster die Interaktion von Arrestin mit Rezeptoren und den nachfolgende Transportmuster von Arrestin Rezeptorkomplexen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden zusätzliche Phosphorylierungsstellen in den C-Terminus des β2-adrenergen Rezeptors eingefügt. Es konnte gezeigt werden, dass die Rezeptormutante β2AR SSS verstärkt phosphoryliert wurde und eine Erhöhung der Affinität zu Arrestin 3 aufwies. Darüber hinaus war das Transportmuster von Arrestin-3 mit diesem Rezeptor verändert. Die Rekrutierung von Arrestin-3 und die Stabilität von Arrestin-3-Rezeptorkomplexen wurden in Echtzeit mittels FRET und FRAP bestimmt. Es wurde gezeigt, dass Arrestin-3 schnell und fast vollständig vom β2AR dissoziiert, während die Interaktion mit dem β2AR SSS 2-4 fach verlängert war. Die Arrestin-Interaktion mit einer β2V2-Rezeptorchimäre war innerhalb des betrachteten Zeitfensters kaum reversibel. Weitere Untersuchungen der Arrestin 3 Lokalisation ergaben, dass zusätzliche Phosphorylierungsstellen im β2AR SSS zur Kolokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen auf Endosomen führte. Der Wildtyp-Rezeptor hingegen interagiert nur transient mit Arrestin an der Plasmamebran. Der β2AR SSS internalisierte stärker als der β2AR, das Recycling für beide Rezeptoren verlief jedoch sehr ähnlich. Somit konnte diese Arbeit zeigen, dass die Interaktion zwischen Arrestin und Rezeptoren durch minimale Rezeptormodifikationen verstärkt werden kann und dass diese Veränderung ausreicht, um das Transportverhalten von Arrestin zu verändern. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnten durch MS/MS Experimente ligandenabhängige Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des humanen PTHR bestimmt werden. Dabei wurden drei bisher nicht identifizierte Stellen detektiert: T503, S519 und T547. Die Quantifizierung der agonistabhängigen PTHR-Phosphorylierung ergab, dass vor allem der Bereich zwischen S489 und S495 stark phosphoryliert wird oder für die Phosphorylierung nachfolgender Serin und Threoninreste erforderlich ist. Bei der funktionellen Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen stellte sich hingegen heraus, dass insbesondere die Phosphorylierung zwischen S501-T506, im proximalen PTHR-C-Terminus für die Interaktion mit Arrestin-3 relevant ist. Dieser Bereich spielt für das Ausmaß der Gesamtphosphorylierung des Rezeptors nur eine untergeordnete Rolle. Innerhalb dieses Clusters nehmen T503 und S504 eine wichtige Rolle für die robuste Interaktion mit Arrestin 3 ein. Obwohl die Mutation der Phosphorylierungsstellen im proximalen PTHR-C-Terminus zu Alanin die Interaktion mit Arrestin massiv beeinträchtigte, konnte mit keinem der in dieser Arbeit getesteten Rezeptorkonstrukte eine vollständige Inhibierung der Arrestin-3-Interaktion mit dem PTHR erzielt werden. Dass die Stabilität von Arrestin-Rezeptorkomplexen nicht nur durch Modifikationen auf Rezeptorebene, sondern auch durch Modifikationen in Arrestin beeinflusst werden kann, wurde im dritten Teil dieser Arbeit gezeigt. Selbst konservierende Mutationen in phophatsensitiven Elementen im N-Terminus von Arrestin-3 führten zur Reduktion der Affinität zum β2AR, dem β2AR SSS, dem β2V2R und dem PTHR. Dadurch wurde auch die Kompartimentalisierung dieser Rezeptoren mit Arrestin beeinträchtigt. Die Kolokalisation von Arrestin 3K11,12R mit dem β2V2R und dem β2AR SSS auf Endosomen war zwar verringert, jedoch nicht ganz aufgehoben. Mit dem PTHR hingegen war kein endosomaler Kotransport mit Arrestin 3K11,12R zu beobachten. Daraus geht hervor, dass die Rolle der beiden Lysine für die Kompartimentalisierung von Arrestin-Rezeptorkomplexen nicht für alle Rezeptoren einheitlich ist. Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass Arrestin unterschiedliche Phosphorylierungszustände im proximalen C-Terminus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren erkennen kann. Die zeitliche Stabilität von Arrestin-Rezeptorkomplexen wird durch die Anzahl und die Lokalisation von Phosphorylierungsstellen im C-Terminus von Rezeptoren bestimmt. Dies wirkt sich auch auf die zelluläre Lokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen aus: Je höher die zeitliche Stabilität eines Arrestin-Rezeptor-Komplexes ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass diese in intrazellulären Kompartimenten, wie Endosomen zu finden sind. Diese Befunde unterstützen die Hypothese, dass Arrestin rezeptorspezifische und phosphorylierungsspezifische Komplexe bilden kann.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2015.0369