Purification and Functional Characterization of Recombinant Human ADAM8 protease

From recent studies in different tumor entities it became apparent that the membrane-anchored metalloprotease-disintegrin ADAM8 plays an active role in tumor progression and consequently in patient prognosis. It is therefore desirable to understand the functional role of ADAM8 in vitro by characteri...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Xiangdi Yu
Beteiligte: Bartsch, Jörg W. (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2015
Medizin
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2015.0272
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Inhaltsangabe:
  • In einer Reihe von klinischen Studien wurde nachgewiesen, dass die membranständige Metalloprotease ADAM8 eine Rolle bei der Tumorprogression spielt und eine erhöhte ADAM8-Expression mit einer verschlechterten Patientenprognose einhergeht. Es ist daher notwendig, die Rolle der ADAM8-Aktivität in vitro zu verstehen. In dieser Arbeit sollte daher die lösliche Variante von ADAM8, die Ektodomäne (hEctoA8), aufgereinigt und funktionell charakterisiert warden. Diese besteht aus der Prodomäne, der Metalloprotease-Domäne (MP), der Disintegrin-Domäne (DIS), der Cystein-reichen Domäne (Cys) and der EGF-artigen Domäne (EGF). Die autokatalytische Entfernung der Prodomäne führt zur aktiven Protease. Wie das gesamte ADAM8-Molekül auch, enthält das rekombinanten Protein hEctoA8 die für Metzinkine charakteristische Konsensus-Sequenz “HEXXHXXGXXHD” in der MP-Domäne und sollte daher proteolytische Aktivität besitzen. Bis heute war es nur schwer möglich, funktionelle Studien mit ADAM8 in vitro durchzuführen, da nicht genügend rekombinantes Protein mit biologischer Aktivität zur Verfügung stand. In dieser Arbeit wurde das rekombinante humane ADAM8 als hEctoA8 erfolgreich aus Überständen von stabil transfizierten und selektionierten HEK293 Zellen aufgereinigt. Das so gewonnene Protein hEctoA8 besitzt eine hohe katalytische Aktivität und kann in einem FRET-basierten Assay ein Fluoreszenz-gequenchtes Peptid spalten, das der ADAM8-Spaltstelle im niedrig-affinen IgE Rezeptor CD23 nachempfunden ist. Interessanterweise wird auch intaktes membranständiges CD23 von der Oberfläche stabiler CD23-exprimierender Zellen in Fragmente von 37, 33, 25 and 16 kDa abgespalten, womit erstmalig eine Susbtratspaltung in trans nachgewiesen wurde. Weiterhin wurden die ADAM8-Spaltstellen für das extrazelluläre Matrixprotein Fibronectin (FN) charakterisiert. Es entstanden dabei 9 FN-Fragmente von unterschiedlichem Molekulargewicht. Ein FN-Fragment mit einem Molekulargewicht von 38 kDa war dabei besonders interessant, da es so genannte Zellbindungsdomänen sowie ein RGD-Motiv enthält. Durch die ADAM8-abhängige Spaltung dieses Fragments kann man davon ausgehen, dass eine durch FN vermittelte Zelladhäsion verloren gehen sollte. Diese Hypothese wurde durch Pankreas-Tumorzellen Panc1 überprüft, bei denen eine ADAM8-abhängige Zelladhäsion auf FN mit und ohne vorherigen Verdau gemessen wurde. Es konnte gezeigt werden, dass der Verdau von Fibronektin durch ADAM8 die Zelladhäsion signifikant reduzierte. Die Expression des daran beteiligten Fibronektin-Rezeptors 5 1 wurde auf Proteinebene untersucht und dabei gezeigt, dass spezifisch die Integrin 5-Untereinheit vermindert ist, während die Integrin 1-Untereinheit nicht verändert ist. Auch die vom Fibronektin-Rezeptor abhängige Signalkaskade, an der unter anderem die Kinasen p-ERK1/2 und p-Akt beteiligt sind, zeigt keine Änderungen im Aktivierungsstatus, sodass man daraus schliessen kann, dass die von ADAM8 vermittelte Degradation von FN direkt über die Regulation der Integrin 5-Untereinheit zu einer verminderten Zelladhäsion führt.