Biochemical Investigations on Microbial Prenyltransferases in the Presence of DMAPP Analogues

Plants, bacteria and fungi provide a plethora of diverse structures derived from the primary as well as the secondary metabolism. Representative substances from secondary metabolite pathways are flavonoids, coumarins, xanthones and indole alkaloids. Although not necessary for the growth and reproduc...

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Main Author: Liebhold, Mike Patrick
Contributors: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2014
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Pflanzen, Bakterien und Pilze weisen eine Fülle an unterschiedlichen Strukturen sowohl aus dem Primär- als auch aus dem Sekundärstoffwechsel auf. Vertreter, der aus dem Sekundärstoffwechsel stammenden Substanzen, sind unter anderem Flavonoide, Coumarine, Xanthone und Indol-Alkaloide. Wenngleich sie nicht essenziell für das Wachstum und die Reproduktion der entsprechenden Organismen sind, verschaffen diese Stoffe ihren Produzenten dennoch einen Vorteil gegenüber anderen Organismen, zum Beispiel in Form von Lockstoffen, als Fraßschutz sowie als Abwehrstoffe gegen Konkurrenten. Das Anbringen von Isopren Einheiten (n C5) wie zum Beispiel Dimethylallyl-, Geranyl- oder Farnesyl Gruppen an diese Grundstrukturen aus dem Sekundärstoffwechsel ist ein weiterer Schritt zur breiten Differenzierung dieser Stoffe. In der Natur bewerkstelligen Prenyltransferasen diese Prenylierungsreaktion. Prenylierte Naturstoffe weisen, im Gegensatz zu ihren Substraten, oftmals starke pharmakologische Wirkungen auf. Daher stellen sie interessante Moleküle für die Entwicklung von Arzneistoffen dar. Untersuchungen an, mit Hilfe von Prenyltransferasen übertragbaren, alternativen Alkyl Resten, sogenannten Prenyl-Diphosphat Analogen, könnten eine wichtige Rolle beim Verstehen der katalytischen Mechanismen dieser Enzyme und ebenso bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe spielen. Zu Beginn dieser Dissertation wurde die Akzeptanz vier chemisch synthetisierter Alkyl- und Allyl Diphosphate durch drei L-Tryptophan-Prenyltransferasen (FgaPT2, 5 DMATS, 7 DMATS) aufgeklärt. Wurde die Doppelbindung an β Position beibehalten und nur die Methylgruppen verändert, so führte dies zur Bildung von regulär alkylierten Produkten und zeigten damit die erfolgreiche Anwendung von DMAPP-Analoga. Es wurde jedoch eine teilweise bzw. vollständige Verschiebung der Regiospezifität der verwendeten Prenyltransferasen beobachtet, abhängig vom eingesetzten DMAPP Analog. Die Enzyme katalysierten hingegen nicht die Übertragung von Alkyl-Diphosphaten mit fehlender oder bzw. nach Position verschobener Doppelbindung. Weiterhin wurde das Verhalten zyklischer Dipeptid-Prenyltransferasen (AnaPT, CdpNPT, CdpC3PT, FtmPT1, BrePT) gegenüber unatürlichen Alkyl- und Allyl Donoren untersucht. Die zyklischen Dipeptid-Prenyltransferasen akzeptierten ebenfalls die ungesättigten DMAPP Analoga MAPP und 2-pentenyl-PP und führten zur Bildung mehrerer Produkte. Ungeachtet der Position und Ausrichtung des Prenyl-Restes (C-2 oder C 3) in Anwesenheit von DMAPP, brachten die Reaktionen dieser Enzyme eine Mischung von C2- sowie C3-revers alkylierten Diastereomeren in unterschiedlichen Verhältnissen hervor, abhängig vom gewählten Donor sowie Enzym. Nach der erfolgreichen Alkylierung von L Tryptophan sowie Tryptophan-haltigen zyklischen Dipeptiden mittels einfacher allylischer DMAPP-Analoga wurde die Akzeptanz eines strukturell komplexeren DMAPP-Analogons (Benzyl-Diphosphat) getestet. Vorangegangene Untersuchungen zeigten, dass mehrere L Tryptophan- sowie zyklische Dipeptid-Prenyltransferasen diesen Benzyl-Donor akzeptierten, wobei FgaPT2 den höchsten Umsatz verzeichnete. FgaPT2 wies außerdem eine breite Substratspezifität auf und nutzte sowohl L Tryptophan als auch verschiedene Derivate hiervon. In diesen Fällen katalysierte diese Prenyltransferase mit hoher Regiospezifität eine C5 Benzylierung, was eine vollständige Verschiebung der Prenylierungposition von Position C-4 darstellt. Um die Untersuchungen bezüglich der Akzeptanz nicht natürlicher Alkyl- sowie Benzyl Analoga abzurunden, wurden verschiedene Enzyme, welche Tryptophan an den Positionen C 5, C-6 oder C-7 prenylieren, aus Pilzen wie auch aus Bakterien zusammen mit den drei DMAPP Analoga inkubiert. Je nach verwendetem Enzym konnten bis zu vier Produkte isoliert werden. In allen Enzymassays war C6-alkyliertes oder benzyliertes L-Tryptophan das Hauptprodukt. Position C-6 des Indolringes wurde somit für die C-5, C-6 oder C-7 prenylierenden Enzyme zur bevorzugten Angriffspunkt für die Übertragung der Alkyl- oder des Benzyl-Restes. Die in dieser Dissertation genannten Ergebnisse zeigen, dass sowohl Allyl- als auch Benzyl Analoga von DMAPP als mögliche Alternativen für chemoenzymatische Friedel Crafts Alkylierungen zur Herstellung unnatürlich alkylierter Substanzen verwendet werden können.