Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Prenyltransferasen und NRPS-ähnlichen Enzymen aus Ascomyceten

Um ihr eigenes Überleben zu sichern und sich Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt zu verschaffen, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, bioaktive Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese kann sich der Mensch als Antibiotika, Immunsuppressiva oder als Leitsubstanzen für die Ent...

Ausführliche Beschreibung

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1. Verfasser: Tarcz, Sylwia Magdalena
Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2014
Pharmazeutische Biologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2014.0563
Schlagworte:
O
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:Um ihr eigenes Überleben zu sichern und sich Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt zu verschaffen, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, bioaktive Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese kann sich der Mensch als Antibiotika, Immunsuppressiva oder als Leitsubstanzen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe wie HIV-Proteaseinhibitoren oder Insulinmimetika ebenfalls zu Nutze machen. Damit stellen sie eine wichtige Quelle potentiell nutzbarer Wirkstoffe dar. Große Fortschritte wurden in den vergangenen Jahrzehnten auf dem Gebiet der Erforschung der für die Biosynthese dieser Metabolite notwendigen mikrobiellen Werkzeuge gemacht. Einerseits sind nichtribosomale Peptidsynthetasen und Polyketidsynthasen weit verbreitete Enzyme, die in viele Biosynthesen von Grundstrukturen involviert sind und aufgrund ihrer modularen Struktur viel Spielraum für Manipulationen durch die Synthetische Biologie bieten. Andererseits können Sekundärmetabolite durch Modifikationsenzyme (tailoring enzymes) wie z. B. Prenyltransferasen weiter verarbeitet werden, was ihre biologische Aktivität häufig erhöht. Um diese Enzyme gezielt einsetzen zu können, ist es von essentieller Bedeutung, ihre Struktur und Funktion zu untersuchen und zu verstehen. Zahlreiche prenylierte Bisindolylbenzochinone aus der Gruppe der prenylierten Indol-alkaloide konnten bereits aus Ascomyceten isoliert werden, biochemische Informationen waren bisher allerdings nur für die Biosynthese von Terrechinon A in Aspergillus nidulans verfügbar. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten die putativen Prenyltransferasegene astPT und ATEG_00702 (EAU39348) aus Aspergillus terreus heterolog in Escherichia coli exprimiert und anschließend bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Das rekombinante Protein AstPT katalysierte in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die N- und C-Prenylierung von Asterrichinon D (AQ D). Als enzymatische Produkte konnten zwei mono- und zwei diprenylierte Substanzen isoliert werden, deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie aufgeklärt wurden. Wie andere Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie war AstPT in seiner Katalyse unabhängig von Metallionen und folgte der Michaelis-Menten-Kinetik mit einer Michaelis-Konstante von 463 µM und einer Wechselzahl von 0,16 1/s für AQ D bzw. von 33,5 µM und 0,02 1/s für DMAPP. Besonderheiten von AstPT sind die Einführung von Prenyleinheiten an zwei verschiedenen Positionen des Substrates und zum anderen die hohe Spezifität für seine aromatischen Substrate. AstPT akzeptierte weder Aminosäuren noch cyclische Dipeptide, wie sonst typisch für Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie. Hingegen akzeptierte sie vier Hydroxyxanthonderivate als Substrate und katalysierte O-Prenylierungen in Anwesenheit von DMAPP, Geranyl- (GPP) und Farnesyldiphosphat (FPP), was bisher nur für ein Enzym der DMATS-Superfamilie beobachtet werden konnte. Die Michaelis-Konstante für das beste Xanthonderivat wurde mit 17,3 µM bestimmt, allerdings war die Wechselzahl für AQ D um das 160-fache höher als für das Xanthonderivat. EAU39348 konnte AQ D nicht umsetzen, mit Didemethylasterrichinon D (DDAQ D) als aromatisches Substrat war hingegen die Bildung von mehreren Produkten zu beobachten. Die langsame Umsetzung von AQ D durch AstPT und die alleinige Umsetzung von DDAQ D durch EAU39348 deuten auf eine bevorzugte Produktion von DDAQ D-Derivaten in Aspergillus terreus hin, die in deren höherer Bioaktivität begründet sein könnte. Ein drittes putatives Prenyltransferasegen, CHGG_03684, konnte aus Chaetomium globosum kloniert und in verschiedenen Expressionssystemen getestet werden. Unter diesen Bedingungen konnte jedoch kein lösliches Protein erhalten werden. Nach Solubilisierung der Protein-Einschlusskörper mittels Harnstoff wurde eine Renaturierung durch Dialyse versucht. Mit dem erhaltenen Protein und AQ D konnte in Anwesenheit von DMAPP keine Umsetzung beobachtet werden. Des Weiteren wurden vier putative, NRPS-ähnliche Gene aus Aspergillus terreus bzw. Chaetomium globosum mittels PCR amplifiziert. ATEG_02004, ATEG_03563 und CHGG_03687 konnten in den Expressionsvektor pJW24 kloniert werden, der pyrG als Selektionsmarker für die anschließende Transformation trägt. Das Konstrukt mit ATEG_02004 konnte erfolgreich in Aspergillus niger AB 1.13 eingebracht und die Integration in Genom mittels PCR nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Sekundärmetabolit-produktion der Transformanten führte allerdings nicht zur Identifizierung der Funktion von ATEG_02004. In einem weiteren Projekt innerhalb dieser Arbeit wurde die Bedeutung verschiedener Aminosäuren in FtmPT1 untersucht, um den auf der Enzymstruktur basierten Reaktions-mechanismus zu bestätigen. Durch zielgerichtete Mutagenese mittels PCR und anschließende Überproduktion und Aktivitätstests konnte die Beteiligung des Glutamatrests 102 an der Stabilisierung des Indolstickstoffs über Wasserstoffbrückenbindungen und seine Rolle als Protonenakzeptor während der Katalyse gezeigt werden. Der Austausch von Glycin 115 führte zur Änderung der Prenylierungsposition von C 2 nach C 3 unter Entstehung eines Hexahydropyrroloindols. Dies konnte sowohl für das natürliche Substrat von FtmPT1, Brevianamid F, als auch für verschiedene cyclische Dipeptide nachgewiesen werden. Damit wurde die essentielle Rolle von G115 in der Prenylierung in FtmPT1 aufgezeigt. Mutationen der entsprechenden Aminosäure in CdpC3PT, A115, senkten nur die Aktivität. Mit dem Austausch von Tyrosin 205 gegen Phenylalanin konnte die Akzeptanz von sechs Hydroxynaphthalinderivaten gegenüber dem Wildtypprotein verbessert werden.
DOI:http://dx.doi.org/10.17192/z2014.0563