Regulation of Rho-activating proteins by heterotrimeric G proteins: Sensitivity of Gα RhoGEF interaction is determined by dissociation kinetics

Die Aktivierung der RhoGTPasen durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren ist wichtig für viele physiologische Funktionen wie etwa die Blutdruckregulation. Am besten sind die Unterfamilien Rho, Rac und Cdc42 der RhoGTPasen verstanden. In der vorliegenden Arbeit liegt der Fokus auf Signaltransduktions-Mechanismen, welche RhoA aktivieren. Aktives RhoA reguliert zum Beispiel das Zytoskelett durch seinen Einfluss auf die Aktin-Dynamik und reguliert die Rho-Kinase ROCK, welche die Myosin-Leichtketten-Phosphatase durch Phosphorylierung inaktiviert. RhoA induziert weiterhin mittels des Serum responsiven Faktors Gentranskription. Die meisten RhoGTPasen wechseln zwischen einem GDP-gebunden inaktiven und einem GTP-gebunden aktiven Zustand hin und her. Der Austausch von GDP durch GTP und somit die Aktivierung wird durch Rho Guanin Austausch Faktoren (RhoGEFs) vermittelt. Die größte Familie der RhoA-aktivierenden RhoGEFs ist funktionell und strukturell durch eine DH Domäne und eine direkt anschließenden PH Domäne charakterisiert. Die DH Domäne stellt die GEF Aktivität bereit, die PH Domäne hat vor allem regulatorische Funktionen. Manche dieser RhoGEFs werden durch Gαq/11 und/oder Gα12/13 aktiviert. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Regulation dieser RhoGEFs. Unterhalb von Gα13 werden RH RhoGEFs aktiviert. Alle RH-RhoGEFs besitzen eine Regulator of G protein signaling (RGS) homologe (RH) Domäne zusätzlich zur DH-PH Domäne, welche auch das Gαq-aktivierte p63RhoGEF besitzt. Nach genetischer Depletion des RH-RhoGEFs LARG sind Mäuse gegen Salz-induzierten Bluthochdruck geschützt und die akute Reaktion auf Behandlung mit Angiotensin II fehlt den p63RhoGEF defizienten Mäusen. Trotzdem war bisher unklar, warum RhoGEFs durch zwei Gα-Unterfamilien aktiviert werden. Auch über die zeitliche und räumliche Dynamik der Rezeptor-vermittelten Aktivierung war wenig bekannt. Deshalb entwickelten wir FRET-basierte Messmethoden, welche es ermöglichen, die RhoGEF Aktivierung zum ersten Mal in lebenden Zellen zu beobachten. FRET findet zwischen zwei Fluorophoren statt - in dieser Studie sind die Fluorophore an interessierende Proteine fusioniert –, welche einen Abstand von höchsten 10nm besitzen. Daher reflektiert ein Anstieg im FRET nach Stimulation mit dem Agonisten die Annäherung der interessierenden Proteine. In einzelnen, lebenden Zellen wurden Änderungen in FRET mit einer Hochgeschwindigkeitskamera detektiert. Die Interaktion zwischen LARG und Gα13 wurde in Zellen beobachtet, welche mit Gα13-mTur2 und YFP-LARG transfiziert waren. Die Stimulation des Thromboxan A2 Rezeptors führte zu einem robusten Anstieg des FRET Signals. Wie sich in der langsamen Abnahme des FRET Signals zwischen LARG und Gα13 zeigte, dissoziierten LARG und Gα13 deutlich langsamer (t1/2>5min) als Gα13 inaktivierte (t1/2=17,50s). Dies konnte auch in der Kinetik der LARG Translokation zur Plasmamembrane beobachtet werden. Somit verursacht die Aktivierung des Gα13, dessen schnelle Interaktion mit LARG. Bemerkenswerterweise inhibiert LARG entweder die Gα13´s Inaktivierung oder es bindet an Gα13 nach dessen Inaktivierung. Wir gehen davon aus, dass die verlängerte Interaktion die Ursache für die fast 100fach erhöhte Sensitivität der LARG-Gα13-Interaktion für die Stimulation mit einem Thromboxan Agonisten im Vergleich zur Gα13-Aktivierung ist. Die Aktivierung von p63RhoGEF wurde durch Beobachtung der Interaktion von Gαq-CFP und Venus-p63RhoGEF untersucht. Ein robuster Anstieg im FRET wurde nach Stimulation von Gαq-gekoppelten Rezeptoren detektiert. Im Gegensatz zur LARG-Gα13-Interaktion reflektiert die p63RhoGEF-Gαq-Interaktion zeitlich sehr genau sowohl die Gαq-Aktivierung als auch seine Inaktivierung. Außerdem zeigen die p63RhoGEF-Gαq-Interaktion und die Gαq-Aktivierung eine ähnliche Sensitivität (EC50 von 500nM Histamin). Beide Beobachtungen wurden auch in einem trimären Komplex aus p63RhoGEF, Gαq und RGS2 bestätigt. In der Vergangenheit wurde eine beschleunigte Gαq-Inaktivierung durch RGS2 in vitro beschrieben und auch wir beobachteten eine beschleunigte Dissoziation von p63RhoGEF und Gαq in Anwesenheit von RGS2. Zusätzlich konnten wir einen Anstieg im FRET zwischen p63RhoGEF und RGS2 beobachten. Diese Beobachtung war der erste Beweis für diesen trimären Komplex in lebenden Zellen und unterstützt das Konzept eines funktionalen, aktivierungsabhängigen p63RhoGEFGαq-RGS2-Komplexes. In diesem Komplex inhibiert RGS2 die nachgeordnete Signalweiterleitung. Zusammenfassend werden sowohl LARG als auch p63RhoGEF durch die Stimulation der G-Protein gekoppelter Rezeptoren aktiviert. Trotzdem ist LARGs Sensitivität für die Rezeptoraktivierung deutlich höher und die Dauer der Signalweiterleitung länger als es für p63RhoGEF gezeigt wurde. Die Inaktivierung von p63RhoGEF wird zudem durch RGS2 weiter beschleunigt. Dies hat eine Abnahme der nachgeordneten Signalweiterleitung zur Folge.