Investigations on lin-Benzopurines With Respect to Dissociation Behavior, Pocket Cross-Talk, Targeting Resistance Mutants, Residual Mobility, and Scaffold Optimization

Die vorliegende Arbeit behandelt die Charakterisierung und Optimierung selektiver Antibiotika gegen das Enzym tRNA-Guanin Transglykosylase. Kürzlich wurde das lin-Benzopurin-Grundgerüst als Ausgangspunkt für das strukturbasierte Wirkstoffdesign eingeführt. Zwei Klassen wurden als potente TGT-Inhibitoren identifiziert, lin-Benzoguanine und lin-Benzohypoxanthine. Allerdings zeigen diese Liganden keine idealen Eigenschaften in Bezug auf Metabolismus und Pharmakokinetik: Zum einen weisen sie eine geringe Permeation durch Zellmembranen auf. Zum anderen ist ihr 2-Substituent nur schwach durch Differenzelektronendichte in Kristallstrukturen definiert. Dies erschwert eine Struktur–Wirkungsbeziehung aufzustellen. In einer umfassenden Studie wurde der Protonierungszustand der lin-Benzopurine untersucht. Mit lin-Benzoguaninen durchgeführte ITC-Messungen suggerierten die Aufnahme eines Protons durch den Liganden. Diese Protonierung erfolgt am basischen Stickstoff der Guanidinstruktur im Aminopyrimidinonteil des Grundgerüstes. lin-Benzohypoxanthine weisen dieses Verhalten nicht auf. pKa-Berechnungen stützen diese Beobachtung. Während die lin-Benzohypoxanthine an eine dem Apo-Enzym ähnelnde Konformation der TGT binden, bei der die Liganden mit nur einem Aspartat in der G34-Tasche interagieren, induziert die zusätzliche Aminogruppe der lin-Benzoguanine die Rotation einer zweiten Aspartatseitenkette zur Bindetasche. Nur die negativ geladene Umgebung beider Aspartate in kurzer Distanz induziert eine pKa-Wertänderung der lin-Benzoguanine, die stark genug ist, um eine Protonenaufnahme zu begünstigen. Diese Hypothese konnte durch Mutationsstudien abgesichert werden. Unter Berücksichtigung der gemessenen Bindungsaffinitäten war eine flache Struktur–Wirkungsbeziehung der lin-Benzopurine zu beobachten. Daher wurden zusätzliche Einblicke in treibende Kräfte der Bindung über die Aufspaltung von ∆G in ∆H und -T∆S gewonnen. Wie erwartet, binden beide Ligandserien enthalpisch. Dabei weisen die lin-Benzohypoxanthine eine weniger ausgeprägte Enthalpie auf, da die Interaktion zum zweiten Aspartat in der G34-Tasche fehlt. Diese kann teilweise durch ein kristallographisch konserviertes Wassernetzwerk am Grunde der Tasche kompensiert werden. Während die thermodynamischen Profile der lin-Benzohypoxanthine fast unverändert bleiben, sind die Daten der lin-Benzoguanine divers. Offensichtlich ermöglichen strukturelle Änderungen induziert durch die Rotation des Aspartatrestes im Falle der lin-Benzoguanine eine Kommunikation zwischen U33-Tasche, die vom 2-Substituenten adressiert wird, und G34-Tasche, die das Grundgerüst besetzt. Weiterhin wurde am Beispiel der 2-Amino-lin-Benzoguanine getestet, ob ein Ligand mit hoher residualer Beweglichkeit einen Bindungsverlust im Falle einer Resistenzentwicklung eher vermeiden kann als ein Ligand mit geordnetem Bindungsmodus. Nach Identifizierung einer geeigneten Mutationsstelle folgten Expression und Kristallisation verschiedener TGT-Mutanten. Die für unterschiedliche 2-Amino-lin-Benzoguanine bestimmten Bindungsaffinitäten konnten eher in Zusammenhang mit dem Grundgerüst gebracht werden, das Unordnung seitens des Proteins in naher Umgebung zur Mutationsstelle verursacht, als mit den verschiedenen 2-Substituenten. Marginale Unterschiede konnten den Eigenschaften der Substituenten zugeschrieben werden, die auf elektrostatische Anziehungs- und Abstoßungskräfte zurückzuführen sind. Weitere Experimente nutzten MD-Simulationen, um den Bindungsmodus neuartiger 2-Amino-lin-Benzoguanine vorauszusagen. Anschließend verfeinerte Datensätze deckten neuartige Aspekte für das weitere Design und die Charakterisierung von TGT-Inhibitoren auf: Erstens konnte den 2-Substituenten Differenzelektronendichte in der Ribose-32-Tasche zugeordnet werden, die zuvor noch nie durch Inhibitoren besetzt wurde. Zweitens unterstreichen die Ergebnisse die Wichtigkeit der verwendeten Kristallisationsbedingungen. Schlecht definierte Elektronendichte deutet nicht notwendigerweise auf Liganden oder Substituenten hin, die eine hohe Beweglichkeit im proteingebundenen Zustand besitzen. Das verwendete Kristallisationsprotokoll beeinflusst die erhaltene Differenzelektronendichte maßgeblich und muss in entsprechenden Diskussionen berücksichtigt werden. Die Substanzklasse der 5-Azacytosine wurde als neuartiges Grundgerüst für TGT-Inhibitoren untersucht. Ähnlich den lin-Benzopurinen sind auch diese vom natürlichen Substrat Guanin abgeleitet. Sie zeigen daher vergleichbare Bindungseigenschaften, jedoch ist die Interaktion zu Asp102 schwach ausgebildet, die sich als äußerst wichtig für Substraterkennung, Ligandprotonierung und Kommunikation zwischen den Bindetaschen herausgestellt hat. Anders als alle bekannten TGT-Inhibitoren binden sie nicht planar an das Protein. In Folge wird der im Vergleich zu den lin-Benzoguaninen niedrigere pKa-Wert nicht in ein Fenster geeignet für die Ligandprotonierung verschoben und die Liganden brechen in der Affinität ein.