Mechanistic and structural analyses of different non-coding RNAs in bacteria

RNase P RNA und 6S RNA sind zwei nicht codierende RNAs die im Grunde in allen (RNase P RNA) oder in den meisten (6S RNA) bekannten Bakterien gefunden wurden. Die Funktion der tRNA Maturation von RNase P ist äußerst wichtig, aber bis jetzt noch nicht vollständig verstanden. Wir begannen den Zwei Meta...

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Main Author: Köhler, Karen
Contributors: Hartmann, Roland Karl (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2014
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:RNase P RNA und 6S RNA sind zwei nicht codierende RNAs die im Grunde in allen (RNase P RNA) oder in den meisten (6S RNA) bekannten Bakterien gefunden wurden. Die Funktion der tRNA Maturation von RNase P ist äußerst wichtig, aber bis jetzt noch nicht vollständig verstanden. Wir begannen den Zwei Metall Ionen Mechanismus mittels NMR Messungen zu untersuchen. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine verkürzte Variante der Escherischia coli (E. coli) RNase P RNA (~370 nt) welcher der größte Teil der Spezifitäts-Domaine fehlt (E. coli RNase P RNA katalytische Domain genannt Ecat), um die Menge an NMR-Signalen zu minimieren. Weiterhin haben wir einige Haarnadel ähnliche Minimalsubstrate entworfen, die eine einzelsträngige 5‘ Leitsequence beinhaltet, um die Nukleotide (Substrate und Ecat), die an dem katalytischen Prozess beteiligt sind, zu ermitteln. Da Ecat die Funktion ein Substrat ohne die Hilfe zu binden und somit zu spalten verloren hat, musste das E. coli RNase P Protein (C5-Protein) zur Reaktion zugesetzt werden. Wir testeten i) die Homogenität der Struktur der Ecat Variante, ii) die Stabilität des C5-Proteins bei längerer Aufbewahrung bei Raumtemperatur und iii) die Effektivität der Spaltung der verschiedenen Minimalsubstrate. Weiter wurde auch die Verwendbarkeit der Minimalsubstrate für folgende NMR Messungen getestet. 6S RNA ist eine bakterielle kleine, nicht-codierende RNA mit einer Länge von ca. 200 nt. Zum ersten Mal beschrieben in E. coli wurde 6S RNA später in allen Bereichen der Bakterienwelt gefunden [Barrick et al., 2005]. Unter ihnen befinden sich die Modellorganismen E. coli und B. subtilis, aber ebenso extremophile Organismen wie Aquificales Bakterien wurde der Besitz einer 6S RNA vorausgesagt. Die Funktion der 6S RNA blieb jahrzehntelang unbekannt. Heutzutage ist bekannt, dass 6S RNA die Transkription reguliert, indem sie mit der RNA-Polymerase (RNAP) interagieren, die die Enzym-eigene Sigma Untereinheit enthält. Diese ist für die Genexpression beim Übergang in die stationären Phase zuständig, welche durch die Bindung an die 6S RNA inhibiert wird [Wassarman und Storz, 2000; Beckmann und Hoch et al., 2012]. Obwohl angenommen wird, dass 6S RNA mit 70 (E. coli) oder A (B. subtilis) abhängige DNA-Promotoren um die Bindung an die A/70-RNAP konkurriert, indem sie eine offene DNA Promotor Struktur imitiert, wurden auch Promotoren, die von anderen Sigma-Faktoren reguliert werden, gefunden, die durch 6S RNA Deletion beeinflusst werden [Wassarman, 2007]. Wenn 6S RNA an die RNAP gebunden ist, wird sie als Matrize zur Transkription kurzer ´Produkt‘ RNAs (pRNAs) verwendet. Während kürzere pRNAs (~ 8 mere) vom Komplex dissoziieren, erreicht die pRNA während der Transkription durch Zugabe frischem Mediums (erneute exponentielle Phase) eine minimale Länge, die zu einer Umlagerung der 6S RNA Struktur führt. Diese wiederum initiiert die Ablösung der 6S RNA:pRNA Hybridstruktur aus dem 6S RNA:RNAP Komplexes [Beckmann und Hoch et al., 2012; Steuten et al., 2014]. Ein 6S RNA Homolog wurde in einer in einer cDNA Bibliothek kleiner RNAs basierend auf einer experimentellen RNomics Studie in dem hyperthermophilien Bakterium Aquifex aeolicus identifiziert [Willkomm et al., 2005]. Diese 6S RNA weist Berechnungen zur Folge die kanonische stäbchenartige Sekundärstruktur mit dem zentralen Bauch Bereich auf. Der zentrale Bauch Bereich ist von zwei Stammstrukturen flankiert: i) der terminale oder Schluss-Stamm, der durch Basen des 5‘- und 3‘-Endes der 6S RNA geformt wird und ii) der interne Stamm mit einer Haarnadel ähnlichen Struktur. Mit nur 163 nt und einem G/C Gehalt von ~ 61% dieser 6S RNA, weist die stabilste Struktur aller bekannten 6S RNAs auf. Diese Arbeit wurde durchgeführt um die Sekundärstruktur der freien A. aeolicus 6S RNA als auch die umgelagerte Struktur nach der 6S RNA:pRNA Hybridisierung mittels NMR zu bestimmen. Es wurden NMR Messungen an der freien 6S RNA als auch an der 6S RNA:pRNA hybridisierten Struktur durchgeführt. Dafür haben wir eine 15-nt pRNA gewählt, deren Sequenz wir in einer mittels Deep Sequencing identifiziert haben. Um eine möglichst kleine RNA (~80 nt; Größenlimit für NMR Messungen) vermessen zu können, wurden zwei durch Mutation verkürzte Varianten der A. aeolicus 6S RNA verwendet (132-nt Variante: Verkürzt durch Mutation des terminalen Stamms; 85 nt Variante: Verkürzt durch Mutation des terminalen und des internen Stammes). Wir konnten durch Vermessung dieser 6S RNA Varianten verschiedene vorhergesagte Stammregionen im terminalen und internen Stammbereich verifizieren und ebenso strukturelle Übergänge durch die pRNA Bindung. Zusätzlich haben wir zur Sekundärstrukturaufklärung enzymatischen und chemischen Sonden Experimenten durchgeführt, zum komplettieren der NMR Daten um ein fein strukturiertes Model zu erhalten. Abschließend konnten wir klären, dass die freie 6S RNA Struktur geformt ist, wie zuvor in silico berechnet. Einige Ergebnisse wichen jedoch immens von den berechneten Vorhersagen ab, wie die Struktur des terminalen Stamms, der nach der pRNA-induzierten Umlagerung weiterhin geschlossen vorliegt. Außerdem konnte keine Ausbildung einer Haarnadelstruktur am 3‘ zentralen Bauch (CB) in der Hybridstruktur, bekannt von z.B. B. subtilis 6S RNA, aufgedeckt werden. In Einklang mit der Berechnung konnten wir den pRNA vermittelten Kollaps des zentralen Bauch Bereiches (CBC) mit einhergehender Bildung der CBC Helix bestätigen. Neben der Strukturaufklärung waren wir ebenfalls an der Funktion dieser 6S RNA interessiert. Um herauszufinden, ob die A. aeolicus 6S RNA die typischen Funktionen einer kanonischen 6S RNA aufweist, verwendeten wir die in Hinsicht auf 6S RNA Bindung und pRNA Transkription gut untersuchte B. subtilis RNAP [Beckmann et al., 2011; Beckmann, Hoch et al., 2012; Burenina et al., 2014]. Durch Verwendung der B. subtilis RNAP konnte gezeigt werden, dass A. aeolicus 6S RNA (132 nt) als Matrize zu pRNA Transkription dient und eine strukturelle Umlagerung vergleichbar zu bekannten 6S RNAs von E. coli und B. subtilis induziert wird. Indes führt die Inhibition der CBC Helix-Bildung sowohl in A. aeolicus als auch in B. subtilis zu einer ineffizienten Ablösung des 6S RNA:pRNA Hybrids von der RNAP. Diese Beobachtung suggeriert, dass eine effektive Ablösung des 6S RNA:pRNA Hybrids aus dem Komplex mit RNAP nur durch pRNAs induziert werden kann, deren Transkription an der kanonischen Position des 5‘ CB gestartet wird.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2014.0394