Cyclophilin A and serine proteases : Targets of neuronal cell death upstream of mitochondrial demise

Mitochondrien gelten als „Kraftwerke“ der Zelle, da sie in Form von ATP die Energie bereitstellen, die für nahezu alle zellulären Prozesse benötigt wird. Zudem sind Mitochondrien an einer Vielzahl von biochemischen Mechanismen und Signalkaskaden beteiligt, wie z.B. der Aufrechterhaltung der intrazellulären Ca2+ Homöostase oder der kontrollierten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. Neben diesen Funktionen spielen Mitochondrien eine zentrale Rolle bei Alterungsprozessen von Zellen und bei intrinsischen Signalkaskaden des programmierten Zelltods. Mitochondrien stellen dabei hochdynamische Organellen dar, die morphologisch entweder lange miteinander verbundene Netzwerke ausbilden oder als kleine kugelförmige Organellen vorliegen. Es besteht ein hochreguliertes Gleichgewicht dieser morphologischen Zustände, das unter pathologischen Bedingungen gestört wird und so zur Dysfunktion der Organellen und zum Zelltod beitragen kann. Entsprechende mitochondriale Veränderungen sind beispielsweise in Neuronen bei altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, sowie nach akuten Hirnschädigungen durch Schädel-Hirn-Trauma oder Schlaganfall nachgewiesen worden. Darüber hinaus wurden sie mit den strukturellen und funktionellen Schädigungen der Organellen und der betroffenen Neurone in Verbindung gebracht. Post-translationale Proteinmodifikationen, Isomerisierung von Proteinen oder Protein-Protein Interaktionen können u.a. der Grund für solche mitochondrialen Fehlfunktionen sein und zum Nervenzelltod beitragen. Aus einer Vielzahl von Forschungsarbeiten ist bekannt, dass Mitochondrien eine zentrale Rolle in den intrinsischen Signalwegen des programmierten Zelltods in Neuronen einnehmen, der vor allem durch die Zerstörung der mitochondrialen Membranintegrität gekennzeichnet ist. Hierbei ist der wesentliche Schritt die Freisetzung des pro-apoptotischen Proteins AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum. Daher waren die Hauptziele der vorliegenden Arbeit, neue Regulatoren der Mitochondrienschädigung und der Freisetzung von AIF in Modellen des programmierten Zelltods zu charakterisieren und diese als mögliche Ziele therapeutischer Angriffspunkte zu definieren. In diesem Zusammenhang wurde die Beteiligung von zwei Peptidyl-prolyl cis-trans Isomerasen CypA und Pin1 sowie von Serinproteasen an mitochondrialen Schädigungsmechanismen untersucht. Die Mehrzahl der Experimente wurde in einer hippokampalen neuronalen Mauszelllinie (HT22 Zellen) durchgeführt. Dabei handelt es sich um ein gut charakterisiertes Modellsystem für oxidativen Stress in Neuronen, das insbesondere für Untersuchungen mitochondrialer Prozesse bei intrinsischen Signalkaskaden des programmierten Zelltods hervorragend geeignet ist. Das bedeutendste Merkmal dieser Form des Zelltods ist die Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien und die anschließende Translokation in den Zellkern, in dem AIF eine Schädigung der DNA hervorruft. Die Ergebnisse aus den HT22 Zellen wurden zudem in weiteren Experimenten im Modell der Glutamat-induzierten Exzitotoxizität in primären Neuronen verifiziert. Der erste Teil dieser Arbeit zeigt, dass CypA in Neuronen eine wichtige Rolle im Glutamat-induzierten Zelltod und der mitochondrialen AIF Freisetzung spielt. Glutamattoxizität führt zu einer Translokation von CypA in den Zellkern, wo es mit AIF einen pro-apoptotischen Komplex bildet, der zur Schädigung der DNA führt. Die verminderte Expression von CypA schützt HT22 Zellen gegen Glutamattoxizität und zudem waren infolge der verminderten CypA-Spiegel die Mitochondrien geschützt. Eine Hemmung der CypA Expression verhindert ferner den Verlust des Mitochondrienmembranpotentials und die Fragmentierung der Organellen als typische morphologische Veränderung der geschädigten Mitochondrien sowie die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum. Weiterhin wurde die Lipidperoxidation in den Zellen deutlich abgeschwächt, die in der Spätphase der Glutamatschädigung durch mitochondriale Schäden gesteigert wird und die Endphase des Zelltods kennzeichnet. Andere Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass Pin1, eine weitere Peptidyl-prolyl cis-trans Isomerase, ebenfalls an neuronalen Zelltodmechanismen und mitochondrialen Veränderungen beteiligt ist. Der spezifische Pin1 Inhibitor Br57 führt zu einer verminderten Empfindlichkeit der HT22 Zellen gegenüber Glutamat. Die dadurch bedingte Zunahme der Zellviabilität ist mit mitochondrialen Veränderungen assoziiert. Die Applikation von Br57 alleine resultiert einerseits in einer zunehmenden Mitochondrienfragmentierung, kann andererseits allerdings die weitere Fragmentierung der Mitochondrien, die durch Glutamat hervorgerufen wird, verhindern. Die erhöhte Mitochondrienteilung war dabei mit einer leichten Reduktion der ATP Spiegel in Br57 behandelten Kontrollzellen verbunden. Jedoch wird der deutliche Abfall der ATP Spiegel, der normalerweise nach Glutamatschädigung auftritt, verhindert. Des Weiteren wird der Glutamat-induzierte Zusammenbruch des Mitochondrienmembranpotentials durch die Pin1 Inhibition günstig beeinflusst. Zusammenfassend zeigt der erste Teil dieser Arbeit, dass beide Peptidyl-prolyl cis-trans Isomerasen, CypA und Pin1, in den intrinsischen Signalkaskaden des neuronalen Zelltods eine besondere Funktion einnehmen. Dabei sind sie offenbar entscheidend an der Regulation der Mitochondrienintegrität und -funktion beteiligt, so dass diese PPIs vielversprechende Angriffspunkte für neue neuroprotektive Strategien darstellen. Der zweite Teil dieser Dissertation befasst sich mit dem Einfluss von aktivierten Serinproteasen auf mitochondriale Funktionen und dem daraus resultierenden Zelltod. Die Hemmung von Serinproteasen mit TLCK, einem Serinproteaseinhibitor, konnte den durch Glutamat-induzierten Zelltod sowohl in HT22 Zellen als auch in primären kortikalen Neuronen verhindern. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die Aktivierung von Serinproteasen zu einem sehr frühen Zeitpunkt in dieser Form des programmierten Zelltods in HT22 Zellen stattfindet, bereits bevor die Aktivierung des pro-apoptotischen Proteins Bid und die daraus folgende Schädigung der Mitochondrien einsetzen. Ferner vermindert der Serinproteaseinhibitor TLCK die Glutamat-induzierte Lipidperoxidation, pathologische und morphologische Veränderungen der Mitochondrien, ATP Depletion sowie die Verminderung des Mitochondrienmembranpotentials und den Abfall der mitochondrialen Atmung. Interessanterweise wird gleichzeitig durch TLCK die Interaktion zwischen Drp1 und CypA verstärkt. Allerdings werden die Freisetzung von Drp1 aus dem Aktinzytoskelett und die darauffolgende Translokation von Drp1 aus dem Zytoplasma zu den Mitochondrien nicht verhindert. Zusammenfassend zeigt der zweite Teil dieser Arbeit, dass Serinproteasen vom Trypsintyp den Glutamat-induzierten oxidativen Zelltod in neuronalen HT22 Zellen vermitteln. Die initiale Aktivierung von Serinproteasen in diesem Modell des programmierten Zelltods ist ein möglicher therapeutischer Ansatzpunkt bei neurologischen Erkrankungen und Alterungsprozessen, bei denen oxidativer Stress und daraus folgende mitochondriale Schädigungsmechanismen wesentlich zur Fortschreitung der pathologischen Veränderungen in den Nervenzellen beitragen.