Molecular biological and biochemical investigations of prenyltransferases from different Aspergillus species

Prenylated aromatic compounds are widely distributed in nature and many of these compounds display interesting biological and pharmaceutical activities. The transfer of prenyl moieties to aromatic substrates is catalysed by aromatic prenyltransferases, and the multitude of possibilities for attac...

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Main Author: Pockrandt, Daniel
Contributors: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2014
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Prenylierte aromatische Verbindungen sind in der Natur weit verbreitet und viele dieser Stoffe besitzten interessante biologische und pharmazeutische Aktivitäten. Die Übertragung der Prenylreste auf aromatische Substrate wird durch aromatische Prenyltransferasen katalysiert und die Vielzahl der Verknüpfungsmöglichkeiten der Prenylreste ermöglicht eine hohe strukturelle Diversität prenylierter Naturstoffe. Untersuchungen zur Funktion von aromatischen Prenyltransferasen geben einen Einblick in die Biosynthesewege dieser Naturstoffe und bieten diese Enzyme als Werkzeuge in der chemoenzymatischen Herstellung von biologisch aktiven Substanzen für pharmazeutische Anwendungen an. Vier putative Prenyltransferasegene der Dimethylallyltryptophan Synthase (DMATS) Superfamilie aus Aspergillus nidulans (A. nidulans) wurden als ein Teil der vorliegenden Arbeit untersucht. Die Gene xptA, xptB, ANID_10289 und ANID_11080 wurden kloniert, und die beiden putativen Xanthon-Prenyltransferasegene xptA und xptB wurden in Escherichia coli (E. coli) überexprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden mittels Affinitätschromatographie mit Ni-NTA aufgereinigt und biochemisch im Hinblick auf ihre Enzymaktivität und Substratspezifität untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte das Enzym XptB als Xanthon- Prenyltransferase bestätigt werden, welche die regiospezifische O-Prenylierung von einigen Xanthonen katalysiert. Die enzymatischen Produkte wurden mittels high performance liquid chromatography (HPLC) isoliert und mithilfe von Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) untersucht. Ein weiteres in der Literatur postuliertes Substrat von XptB, das Benzophenon Arugosin H, wurde unter den getesteten Bedingungen nicht umgesetzt. Für das zweite aufgereinigte Enzym XptA konnte allerdings keine enzymatische Aktivität, weder in Inkubationsansätzen mit dem postulierten Substrat Variecoxanthon A, noch mit anderen potenziellen Substraten nachgewiesen werden. Mit dem Enzym VrtC aus Penicillium aethiopicum (P. aethiopicum) wurde erstmals die Umsetzung einer Naphthacendion-Verbindung mit Geranyldiphosphat (GPP, C10-Einheit) durch eine DMATS-Prenyltransferase beschrieben. Diese Entdeckung führte zu der Annahme, dass nicht alle DMATS-Prenyltransferasen auf den sonst üblichen Prenyldonor Dimethylallyldiphosphat (DMAPP, C5-Einheit) beschränkt sein müssen. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu die bekannten Prenyltransferasen 7-DMATS und CdpNPT, beide aus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), sowie CdpC3PT und AnaPT, beide aus Neosartorya fischeri (N. fischeri), auf die Akzeptanz von GPP und Farnesyldiphosphat (FPP, C15-Einheit) untersucht. Von den untersuchten Enzymen konnte für AnaPT, zusätzlich zu DMAPP, eine Umsetzung von Tryptophan-enthaltenden zyklischen Dipeptiden mit GPP nachgewiesen werden. Für sechs zyklische Dipeptide, für welche mit DMAPP zuvor eine reverse C3α- Prenylierung beobachtet wurde, konnte durch die Verwendung von GPP in der vorliegenden Arbeit die Geranylierung durch AnaPT an den Positionen C-6 und C-7 des Indols nachgewiesen werden. Eine Akzeptanz von sowohl DMAPP als auch GPP durch eine DMATSPrenyltransferase wurde somit erstmals demonstriert. Die Akzeptanz von DMAPP und GPP, sowie die beobachtete Verschiebung der Prenylierungsposition durch den Einsatz von Prenyldonoren unterschiedlicher Länge, erhöhen die Nützlichkeit dieses Enzyms zur chemoenzymatischen Synthese prenylierter Verbindungen. Als letzter Teil dieser Arbeit wurden die drei putativen Prenyltransferasegene AO090102000322, AO090701000600 und AO090020000527 aus Aspergillus oryzae (A. oryzae) kloniert. Das putative Produkt BAE61387 von AO090102000322 wurde in E. coli überproduziert und das rekombinante Enzym erfolgreich aufgereinigt. Durch Sequenzanalysen konnten im Genom von A. oryzae in der Nachbarschaft zu AO090102000322 keine Gene identifiziert werden, welche Aufschluss über ein mögliches natürliches Substrat von BAE61387 geben könnten. Das erhaltene Protein wurde daher mit zahlreichen Substraten von bekannten Enzymen der DMATS-Superfamilie inkubiert. Eine enzymatische Aktivität konnte in Inkubationsansätzen mit einigen Hydroxynaphthalin-Derivaten beobachtet werden. Allerdings wurden diese unnatürlichen Substrate, welche von einigen Mitgliedern der DMATSPrenyltransferasen akzeptiert werden, in Gegenwart von DMAPP, GPP und FPP umgesetzt. Die Akzeptanz der drei Prenyldonoren DMAPP, GPP und FPP zur regiospezifischen CPrenylierung von Hydroxynaphthalin-Derivaten durch eine DMATS-Prenyltransferase wurde zuvor noch nicht demonstriert.