Characterization of the CRISPR-Cas subtype I-B proteins Cas6b and Cas8b of Methanococcus maripaludis C5

Mit dem CRISPR-Cas System wurde ein adaptives Immunsystem identifiziert, mit dem sich sowohl Archaen also auch Bakterien gegen fremde Nukleinsäuren zur Wehr setzen können. Dabei wird die Komplementarität einer kleinen RNA (crRNA) zur eindringenden Nukleinsäure ausgenutzt um diese abzubauen. Namensgebend für dieses System ist der CRISPR-Array oder Lokus, welcher sich aus sich wiederholenden DNA-Sequenzen (Repeats) und einzigartigen Elementen zwischen den Repeats (Spacer) zusammensetzt. Diese Spacersequenzen können aus vorausgegangenen Infektionen von Viren stammen und vermitteln, als Teil der kleinen crRNA, die nötige Komplementarität im Falle einer Neuinfektion. Im Zuge der Co-Evolution von Prokaryoten und ihren Viren hat sich eine hohe Diversität von verschiedenen CRISPR-Cas Systemen entwickelt. Es wird zwischen drei Haupttypen unterschieden, welche in weitere Subtypen unterteilt werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt die erste Charakterisierung eines Subtyp I-B CRISPR-Cas Systems. Die in vivo Aktivität dieses CRISPR-Cas Systems wurde mittels RNA Sequenzierung in Methanococcus maripaludis C5 bestätigt. Die in den RNA-Seq Daten identifizierten crRNAs bestehen jeweils aus einer kompletten Spacersequenz und einer konservierten 8 Nukleotid Sequenz am 5' Terminus sowie einer 2 Nukleotid Sequenz am 3' Terminus. Es wurden 8 cas Gene identifiziert. Von den Cas-Proteinen wurden mit Cas8b und einem zunächst nur mit hypothetischer Funktion annotierten Protein zwei subtypisch spezifische Vertreter genauer analysiert. Für das letzte Protein wurde eine Endoribonuclease-Aktivität identifiziert und das Protein als Cas6b bezeichnet. Cas6b ist ein “single-turnover” Enzym, welches die längeren Vorläufer crRNAs in kleine reife crRNAs prozessiert. Dabei wurde bewiesen, dass Cas6b für die 8 Nukleotid Repeatsequenz am 5' Terminus der reifen crRNAs verantwortlich ist. Trotz einer sehr geringen Sequenzidentität von nur 11%, zeigte eine Modellierung der Cas6b Struktur eine hohe Ähnlichkeit zur Kristallstruktur des in Pyrococcus furiosus identifizierten Cas6 Enzyms. Mit Hilfe von eingefügten Punktmutationen konnten vier Aminosäurereste des katalytischen Zentrums von Cas6b identifiziert werden: Lysin (K30), Histidin (H38), Histidin (H40) und Tyrosin (Y47). Analysen der RNA-Bindefähigkeit von Cas6b haben gezeigt, dass Cas6b nach erfolgter Substratbindung in der Lage ist Dimerstrukturen zu formen. Weitere Untersuchungen mittels „RNA-Crosslinking“ gefolgt von massenspektrometrischen Analysen haben ein Methionrest (M185) identifiziert, welcher eng mit einem Uridin (U15) der Repeatsequenz koordiniert ist. Cas6b Aktivitäts-Assays mit Repeatvarianten von M. maripaludis sowie der Repeatsequenz von Clostridium thermocellum konnten belegen, dass die Prozessierung von Vorläufer crRNA durch Cas6b unabhängig von möglichen Sekundärstrukturen in der RNA stattfindet. Neben dem Vorhandensein von reifen crRNAs geht aus den RNA-Seq Daten auch eine hoche Variabilität der crRNA Häufigtkeit hervor. Um die identifizierten crRNA Mengen zu bewerten, wurde ein experimentaler Ablauf entworfen, mit welchem der Einfluss jeder einzelnen Spacersequenz auf a) die Prozessierung durch Cas6b und b) die Stabilität der crRNAs analysiert werden konnte. Mit Hilfe dieses globalen Analyseansatzes wurden geringe Einflüsse der Spacerlänge sowie Spacersequenz auf die in vitro Prozessierung und Stabilität beobachtet. In diesem Zusammenhang werden zukünftige Experimente auch den Einfluss des Cas-Protein Interferenzkomplexes (Cascade) sowie mögliche regulatorische Effekte auf die Häufigkeit der crRNAs betrachten. Die Charakterisierung des subtypspezifischen Cas8b ergab eine Spaltung des rekombinaten Proteins in zwei definierte Fragmente. Mittels Edman-Sequenzierung wurde die Schnittstelle innerhalb der Proteinsequenz identifiziert. In anderen CRISPR-Cas Subtypen sind zwei Proteine vorhanden, welche als große und kleine Untereinheit des Interferenzkomplexes Cascade beschrieben werden. Im Subtyp I-B hingegen ist Cas8b als einziges äquivalent zu den beiden Proteinen zu finden und es wurde postuliert das seine mögliche autokatalytische Spaltung die kleine und große Cascade-Untereinheit generiert. Die biochemische Charakterisierung von Cas8b und dessen mögliche Rolle innerhalb der Interferenzantwort ergab eine unspezifische Bindefähigkeit zu Nukleinsäuren und konnte keine nukleolytische Aktivität zeigen. Mögliche Funktionen von Cas8b werden diskutiert und in zukünftigen Studien sollen diese im Kontext des Interferenzkomplexes Cascade weiterführend untersucht werden.