English Der Malariaerreger P. falciparum befällt rote Blutkörperchen im Menschen. Bei der Invasion der Erythrozyten formt der Parasit eine sogenannte parasitophore Vakuole (PV), die ihn dann umgibt. Der Parasit verbleibt und entwickelt sich in dieser PV, die ihn vom Zytosol der Wirtszelle schützt. Während des intraerythrozytären Wachstums exportiert der Parasit eine hohe Anzahl seiner eigenen Proteine in die Wirtszelle um sein Überleben in der Wirtszelle zu sichern. Proteine, die entweder in das Zytosol oder der Membran der Wirtszelle exportiert werden, müssen zunächst die Plasmamembran des Parasiten (PPM), die PV und die anliegende parasitophore Vakuolenmembran (PVM) passieren. Der Sekretions- und Exportmechanismus vieler Parasitenproteine ist jedoch noch immer unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es alternative Sekretionswege zum klassichen ER/Golgi Sekretionsweg im Malariaparasiten P. falciparum aufzudecken. Zwei Proteine schienen geeignete Kandidaten eines alternativen Sekretionsweges zu sein: der PfADPRibosylierungsfaktor 1 (ARF1) und die PfAdenylat kinase 2 (AK2). Beide Proteine besitzen eine N-myristoylierungsstelle am N-terminus was auf eine N-myristoylierung des jeweiligen Proteins hindeutet. N-myristoylierung ist eine ko-translationale Modifizierung eines Proteins, wobei eine Fettsäure (Myristat) irreversibel am Glycinrest am N-terminus eines Proteins durch die PfN-myristoyltransferase (NMT) angehängt wird. Eine vorangegangene Proteomuntersuchung der parasitophoren Vakuole und eine Untersuchung mit Reporterkonstrukten ergab für PfARF1 (Proteomuntersuchung) und PfAK2 (Analyse der Reporterkonstrukte) eine PV Lokalisation, obwohl beiden ein Signalpeptid fehlt. Deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass N-myristoylierung womöglich an der Proteinsekretion über die Plasmamembran des Parasiten beteiligt sein könnte. Demnach wurde die subzelluläre Lokalisation der PfARF1/GFP Parasiten und der PfAK2/GFP Parasiten mithilfe von Epifluoreszenzmikroskopie und biochemischen Methoden untersucht. Parallel dazu wurden Reporterkonstrukte generiert und analyisert, bei denen die N-myristoylierungsstelle von PfARF1 (diese Arbeit) und PfAK2 (Ma et al., 2012) entfernt wurden (PfARF1G2A/GFP und PfAK2G2A/GFP). Beim live cell imaging war das Fusionsprotein ARF1/GFP als punktförmige Struktur im Parasiten erkennbar. Der Phänotyp des Fusionsproteins der PfARF1G2A/GFP Parasiten dagegen zeigte ein zytosolisches Signal im Parasiten. Weitere Analysen im Hinblick auf die subzelluläre Lokalisation des PfARF1 deuten auf eine Lokalisation dieses Proteins mit Kompartimenten des frühen Sekretionsweges des Parasiten hin jedoch auf keine Lokalisation in der PV. Im Gegensatz dazu war das Fusionsprotein PfAK2/GFP als ringförmige Struktur sichtbar was auf eine PV Lokalisation hindeutet. Die PfAK2G2A/GFP Parasiten zeigten hingegen eine zytosolische Lokalisation des Fusionsproteins (Ma et al., 2012). Biochemische Untersuchungen konnten zeigen, dass das Fusionsprotein PfAK2/GFP in Anwesenheit der N-myristoylierungsstelle in die PV sekretiert wurde. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der N-terminus von PfAK2 das Protein zur Plasmamembran führt und eine stabile Membranverankerung hervorruft bevor die Translokation über die Plasmamembran des Parasiten erfolgt. Eine mögliche Rolle des frühen Sekretionsweges im Transport von PfAK2 und der Faltungszustand von PfAK2 vor der Translokation über die Parasitenplasmamembran wurden ebenfalls untersucht. Dennoch ist der genaue Mechanismus der Proteintranslokation über die Plasmamembran des Parasiten nicht bekannt. monograph Ein alternativer Sekretionsweg im Malariaparasit Plasmodium falciparum Secretory Pathway ppn:367100126 N-myristoylierung opus:5517 N-myristoylation urn:nbn:de:hebis:04-z2014-02384 Fachbereich Biologie https://doi.org/10.17192/z2014.0238 Life sciences Biowissenschaften, Biologie Sekretionsweg https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2014/0238/cover.png The malaria parasite P. falciparum invades human red blood cells (RBCs). During invasion a compartment surrounding the parasite, the so-called parasitophorous vacuole (PV), is formed. The parasite resides and develops within the PV, which protects the parasite from the host cell cytosol. During its intraerythrocytic growth the parasite exports a vast number of proteins to the host cell in order to maintain its survival within the RBC. Proteins, which are directed to the host cell cytosol and host cell membrane, respectively, therefore are challenged to cross the parasite plasma membrane, the PV and the parasitophorous vacuolar membrane (PVM). However, the secretion and export mechanisms of many parasite proteins are still not understood. The current study focuses on the discovery of an alternative secretory pathway to the ER/Golgi route in the malaria parasite P. falciparum in infected RBCs. Two proteins appeared to be promising candidates of an alternative secretory pathway: the PfADPribosylation factor 1 (ARF1) and the Pfadenylate kinase 2 (AK2). Both proteins contained a N-myristoylation site at their N-terminus, which is indicative for Nmyristoylation. N-myristoylation is a co-translational modification of a protein, whereby a fatty acid (myristate) is irreversibly attached to the glycine residue at the N-terminus of a protein via the PfN-myristoyltransferase (NMT). A preceding proteomic analysis of the parasitophorous vacuole and a reporter construct study proposed for both PfARF1 (determined by a proteomic study) and PfAK2 (determined by a reporter construct study) PV localization although both proteins lacked a signal peptide. That’s why it was hypothesized whether or not N-myristoylation would drive protein secretion across the parasite plasma membrane (PPM). The subcellular localization of the PfARF1/GFP parasites and the PfAK2/GFP parasites, respectively, were analyzed via epifluorescence microscopy and biochemical methods. In parallel, another batch of reporter constructs were generated and analyzed, where the N-myristoylation site of PfARF1 (this study) and PfAK2 (Ma et al., 2012), respectively, was removed (PfARF1G2A/GFP and PfAK2G2A/GFP). Live cell imaging showed that the fusion protein ARF1/GFP was localized as dot-like structures in the parasite. In contrast, the phenotype of the fusion protein of the PfARF1G2A/GFP parasites showed an evenly distributed signal in the parasite cytosol. Further analysis of the subcellular localization of the PfARF1 strongly supports its localization to compartments of the early secretory pathway of the parasite, but no localization in the PV. In contrast, the fusion protein PfAK2/GFP localized to a ring-like structure around the parasite indicating PV localization. The PfAK2G2A/GFP parasites showed a cytosolic localization of the fusion protein (Ma et al., 2012). Biochemical analyses revaled that the fusion protein PfAK2/GFP was secreted into the PV when the N-myristoylation site was present. Furthermore, it could be shown that the N-terminus of the PfAK2 protein is sufficient for parasite plasma membrane targeting, stable membrane anchoring and subsequent protein translocation across the PPM. A possible role of the early secretory pathway in PfAK2 trafficking and the folding state of PfAK2 prior to translocation across the PPM was also examined. However, the exact mechanism how PfAK2 is translocated across the PPM still remains elusive. Plasmodium falciparum ths Prof. Dr. Lingelbach Klaus Lingelbach, Klaus (Prof. Dr.) Philipps-Universität Marburg Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg 2015-11-30 2014-05-02 Thavayogarajah, Thuvaraka Thavayogarajah Thuvaraka Biologie 2014 Plasmodium falciparum doctoralThesis An alternative secretory pathway in the malaria parasite Plasmodium falciparum application/pdf