Untersuchung der Substratspezifität der tRNA-Guanin-Transglykosylase (TGT) aus Eukaryoten und Prokaryoten und Charakterisierung der eukaryotischen TGT

Die bakterielle tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT) katalysiert den Austausch des genetisch kodierten Guanins in der "Wobble"-Position der tRNAsHis,Tyr,Asp,Asn gegen die prämodifizierte Base preQ1, welche dann auf der tRNA-Ebene weiter in die vollständig modifizierte Base Queuin überführt w...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Main Author: Biela, Inna
Contributors: Reuter, Klaus (Prof.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2014
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Description
Summary:Die bakterielle tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT) katalysiert den Austausch des genetisch kodierten Guanins in der "Wobble"-Position der tRNAsHis,Tyr,Asp,Asn gegen die prämodifizierte Base preQ1, welche dann auf der tRNA-Ebene weiter in die vollständig modifizierte Base Queuin überführt wird. Da das Enzym für die Pathogenität von Shigellen, den Erregern der Bakterienruhr, essentiell ist, stellt es ein attraktives Zielmolekül für das computergestütze Design von Wirkstoffen gegen die Shigellose dar. Jedoch verfügen auch Eukaryoten und somit der Mensch über eine TGT. Im Gegensatz zur homodimeren prokaryotischen TGT stellt die eukaryotische TGT ein Heterodimer aus einer katalytischen und einer nicht-katalytischen Untereinheit dar, wobei beide Untereinheiten Homologie zum Protomer des bakteriellen Enzyms aufweisen. Darüber hinaus ist das physiologische Substrat der eukaryotischen TGT nicht preQ1 sondern die vollmodifizierte Base Queuin, denn Eukaryoten sind nicht in der Lage, Queuin de novo zu synthetisieren. Vielmehr erhalten sie diese Base über die Nahrung und über die Darmflora. Da am Mausmodell gezeigt wurde, dass die TGT indirekt für die Umwandlung von Phenylalanin zu Tyrosin erforderlich ist, scheint es dringend geboten, Inhibitoren zu entwickeln, die die bakterielle, nicht jedoch die eukaryotische TGT hemmen. Andernfalls dürfte mit Nebenwirkungen zu rechnen sein, die dem Krankheitsbild der Phenylketonurie ähneln. Es scheint einleuchtend, dass eine möglichst genaue Kenntnis der Unterschiede zwischen dem prokaryotischen und dem eukaryotischen Enzym eine Voraussetzung für die Entwicklung bakterienspezifischer TGT-Inhibitoren ist. Obwohl noch keine Kristallstruktur einer eukaryotischen TGT bestimmt wurde, deuten Homologiemodelle der TGT aus Caenorhabditis elegans und aus dem Menschen darauf hin, dass der Austausch von Cys158 und Val233 in der bakteriellen TGT (Z. mobili TGT-Nummerierung) durch Valin bzw. Glycin in der eukaryotischen TGT einen wichtigen Einfluss auf die Substratspezifität hat. So wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit mutierte Varianten der bakteriellen TGT erzeugt, um die Auswirkungen eines Cys158Val- und eines Val233Gly-Austausches auf die katalytische Aktivität und Substratspezifität zu analysieren. Die Untersuchung der Varianten erfolgte durch Bestimmung ihrer enzymkinetischen Parameter, durch "Microscale-Thermophorese", durch Gelshift-Analysen und schließlich durch Röntgenstrukturanalyse. Obwohl es im Rahmen dieser Studie nicht gelang, eine bakterielle TGT-Variante zu erzeigen, die in der Lage ist, Queuin in die tRNA einzubauen, zeigen die Ergebnisse, dass der Austausch von Cys158 zu Valin eine herabgesetzte Affinität des Enzyms zu preQ1, dem natürlichen Substrat des bakteriellen Enzyms, zur Folge hat. Der Austausch von Val233 zu Glycin führt dagegen zu einer signifikanten Vergrößerung der Substratbindetasche, welche erforderlich ist, um Queuin, das Substrat der eukaryotischen TGT, in einer Konformation zu binden, die mit der intermediär kovalent gebundenen tRNA kompatibel ist. Ein unerwartetes Ergebnis der Studie ist, dass Queuin a priori in die Bindetasche der prokaryotischen TGT binden kann, ohne jedoch als Substrat umgesetzt zu werden. Ziel des zweiten Teils der Dissertation war die biochemische Charakterisierung der eukaryotischen TGT sowie die Durchführung von Kristallisationsversuchen als Vorausetzung für eine Röntgenstrukturanalyse. Zu diesem Zweck wurden zunächst Expressionsplasmide konstruiert, die die effiziente rekombinante Produktion der beiden TGT-Untereinheiten aus der Maus sowie aus dem Menschen in Escherichia coli ermöglichen sollten. Die (separate) Produktion und Reinigung der katalytischen Untereinheit (QTRT1) sowie der nicht-katalytischen Untereinheit (QTRTD1v1) der Maus-TGT erfolgte mit zufriedenstellenden Ausbeuten von jeweils ca. 4 mg pro Liter Bakterienkultur. Dagegen gelang die Reinigung der rekombinanten menschlichen TGT-Untereinheiten nur in unzureichendem Umfang (jeweils < 0,4 mg pro Liter Bakterienkultur), sodass die biochemischen Untersuchungen sowie Kristallisationsversuche weitgehend auf das Maus-Enzym beschränkt blieben. Enzymkinetische Untersuchungen bestätigten frühere Befunde von anderen Arbeitsgruppen, die gezeigt hatten, dass ausschließlich das QTRT1/QTRTD1v1-Heterodimer Enzymaktivität zeigt, während die separaten Untereinheiten völlig inaktiv sind. Darüber hinaus wurde durch NanoESI-MS-Experimente die heterodimere Quartärstruktur der eukaryotischen TGT bestätigt und gezeigt, dass pro Heterodimer gleichzeitig nur ein tRNA-Substrat gebunden und umgesetzt werden kann. Ein weiterer durch NanoESI-MS erhaltener Befund war, dass die katalytische QTRT1-Untereinheit in Abwesenheit des Interaktionspartners in Lösung als Monomer vorliegt, wogegen die nicht-katalytische QTRTD1v1-Untereinheit zumindest in höherer Konzentration ein Homodimer ausbildet. Thermal Shift-Messungen zeigten schließlich, dass sowohl QTRT1 als auch QTRTD1v1 in Hochsalzpuffer (1000 mM NaCl) eine deutlich höhere Stabilität aufweisen als unter Niedrigsalzbedingungen. Kristallisationsversuche, die mit beiden Untereinheiten sowie mit der heterodimeren TGT durchgeführt wurden, lieferten im Fall der nicht-katalytischen QTRTD1v1 reproduzierbare Kristalle, die bei Anwendung von hochfokussierter Synchrotronstrahlung ein Streuvermögen von ca. 2,8 Å zeigten. Von dieser Kristallform wurde an der Beamline 14.1 des BESSY II (Helmholtz-Zentrum, Berlin) ein Datensatz aufgenommen, der die Strukturaufklärung mit der Methode des Molekularen Ersatzes erlaubte. Als Modellkoordinaten dienten dabei die Koordinaten der TGT aus dem Bakterium Thermotoga maritima (PDB-Code 2ASH). Die verfeinerte QTRTD1v1-Struktur zeigt, dass das Protein im Kristall als Homodimer vorliegt, das dem Homodimer der bakteriellen TGT in seinem Aufbau frappierend ähnelt. Voraussetzung für das Design von Inhibitoren, welche spezifisch die bakterielle, nicht jedoch die menschliche TGT inhibieren, ist ein detailliertes biochemisches und strukturelles Verständnis des eukaryotischen Enzyms. Durch die hier erfolgte rekombinante Produktion und Reinigung beider eukaryotischer TGT-Untereinheiten sowie durch die Bestimmung einer ersten Kristallstruktur wurde eine wichtige Grundlage für dieses Ziel geschaffen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2014.0178