(R)-Indolelactyl-CoA dehydratase, the key enzyme of tryptophan reduction to indolepropionate in Clostridium sporogenes

In dieser Arbeit wurde der Weg der Fermentation von Tryptophan zu Indolpropionat in Clostridium sporogenes sowie das Schlüsselenzym Indollactat-Dehydratase untersucht. Die Zwischenprodukte und Endprodukte der Fermentation wurden mittels Massenspektrometrie nachgewiesen. Tryptophan disproportioniert oxidativ über 3-Indolpyruvat zu 3-Indolacetat und reduktiv über (R)-3-Indollactat und (E)-3-Indolacrylat zu 3-Indolpropionat (IPA). IPA, das im menschlichen Darm gebildet wird, gelangt über das Blut ins Gehirn, wo es Sauerstoffradikale (ROS) abfängt und dadurch vor der Alzheimer Krankheit schützen kann. Die Aktivitäten der Enzyme der Tryptophan-Reduktion (Tryptophan Transaminase, Indollactat Dehydrogenase, Indollactat Dehydratase und Indolacrylat Reduktase) wurden in im Rohextrakt von Tryptophan-Kulturen nachgewiesen. In ganz analoger Weise wird Phenylalanin von C. sporogenes über (R)-Phenyllactat und (E)-Zimtat zu Phenylpropionat reduziert. Die Arbeit hat sich besonders auf das Schlüsselenzym Indollactyl-CoA Dehyratase mit einem ungewöhnlichen radikalischen Umpolungs-Mechanismus fokussiert. Die Dehydratase katalysiert die radikalische syn-Eliminierung eines nicht aktivierten Protons in der β-Position und einer OH-Gruppe in der α-Position des Thioestercarbonyls. Erstaunlicherweise zeigt die Dehydratase aus der Tryptophan Kultur eine höhere spezifische Aktivität mit Indollactyl-CoA als mit Phenyllactyl-CoA, während mit der Dehydratase aus der Phenylalanin Kultur das umgekehrte der Fall ist. Beide Enzyme bestehen aus einem Komplex mit je drei Untereinheiten. Mittels Peptide MALDI-TOF Fingerprinting und Nano LC-MS wurden die Untereinheiten als eine CoA-Transferase (FldA) und eine heterodimere Dehydratase (FldBC) identifiziert. Die Peptid Sequenzen der drei Untereinheiten aus Tryptophan sowie Phenylalanin Kulturen sind identisch und werden von denselben Genen fldABC kodiert. Die rekombinante FldBC aus E. coli zeigt sogar eine noch höhere Aktivität als die native Dehydratase FldABC. Die Untereinheit FldB der nativen Dehydratasen hat eine um 2 kDa kleinere molekulare Masse als vom Gen fldB vorausgesagt, wobei die N- und C-Termini erhalten sind, während ein internes 4,3 kDa Peptid beim Peptide-Fingerprinting nicht nachgewiesen werden konnte. Modellierungsversuche von FldBC mit der bekannten Struktur der 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase zeigen, dass die 2. Hälfte des 4,3 kDa Peptids eine Schleife bildet, die durch posttranslationales Spleißen herausgeschnitten werden könnte. Zudem induzieren Phenylalanin und Tryptophan möglicherweise unterschiedliche Schnittstellen, mit denen man die ober erwähnten verschiedenen spezifischen Aktivitäten erklären könnte.