Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen von nichtribosomalen Peptidsynthetasen und Prenyltransferasen in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten aus Ascomyceten

Im Laufe der Evolution, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, eine Vielzahl an strukturell vielseitigen und komplexen Substanzen zu bilden. Unter bestimmten Umweltbedingungen werden Biosynthesewege von komplexen Metaboliten induziert, die wiederum oft eine toxische Wirkung gegenüber den ko...

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1. Verfasser: Mundt,Kathrin
Beteiligte: Li, Shu-Ming (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2013
Pharmazeutische Biologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2014.0031
Schlagworte:
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building Fachbereich Pharmazie
institution Pharmazeutische Biologie
topic prenyltransferases
Schlauchpilze
fungi
Molekularbiologie
Prenyltransferasen
Peptidsynthetasen
Biochemie
Naturwissenschaften
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In the course of evolution, microorganisms have developed the ability for production of a multiplicity of structural diverse and complex compounds. Under given environmental conditions, biosynthetic pathways are induced to synthesize complex metabolites that are often toxic toward their competing organisms. Especially production of secondary metabolites of filamentous fungi is one of the most important source of biological active substances, which can be used for the benefit of human health. Notably, the enzyme classes of polyketide synthases (PKS), nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and NRPS/PKS-hybrids are responsible for the production of novel natural products that exhibit considerable therapeutic potential, e.g. antibiotics, antifungal and immunospuppressive drugs. These natural products can be further modified by other enzymes e.g. prenyltransferases, consequently leading to a huge structural diversity. For discovery and development of new drugs, understanding of reaction mechanism of enzymes in nature is mandatory and especially biochemical investigations become more important. In this thesis, functions of two unknown prenyltransferases (FtmPT3, CdpC2PT) of Neosartorya fischeri (N. fischeri) were biochemically identified and characterised. The gene ftmPT3, encodes a prenyltransferase, which catalyses in the presence of DMAPP the prenylation of verruculogen at OH-13 and therefore acts as the long-time missing O-prenyltransferase in the fumitremorgin A biosynthesis. Intensive sequence analyses of ftmPT3 and its adjacent neighbour genes revealed, in comparison to Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), an additional locus with a size of 9.6 kb and seven putative genes. The protein CdpC2PT, shows sequence identities of 40 % with the C2-prenyltransferase BrePT from Aspergillus versicolor and 42 % with NotF from Aspergillus sp. on the amino acid level. Investigations of reaction mixtures of CdpC2PT with DMAPP, showed a broad substrate specifity towards cyclic dipetides with preference for (S)-benzodiazepindione and cyclo-L-Trp-L-Trp. NMR and MS analyses of the enzymatic products revealed unequivocally that CdpC2PT acts as a reverse C2-prenyltransferase and catalyses the mono- and diprenylation of cyclo-L-Trp-L-Trp. Literature search showed the existence of mono- and diprenylated derivatives of cyclo-L-Trp-L-Trp in Penicillium fellutanum (P. fellutanum), socalled fellutanines. Therefore, it can be speculated that CdpC2PT could be involved in the biosynthesis of fellutanines in N. fischeri. Sequence analyses of the neighbour genes revealed the existence of a putative amino oxidase EAW25547, which could be contribute to the biosynthesis of fellutanines. The coding gene NFIA_043660 was successfully amplified from genomic DNA (gDNA) of N. fischeri and subsequently cloned into both expression vectors pQE60 and pHIS8. After incubation under different expression conditions no protein overproduction could be shown. Furthermore, the gene NFIA_062330, encoding for the last unkonwon putative prenyltransferase of N. fischeri, was biochemically investigated. Sequence analyses revealed an orthologous gene ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus), with a sequence identity of 62 % on the amino acid level. Both genes NFIA_062330 and ACLA_042210 were amplified from gDNA and cloned into the expression vector pQE60. Expression of the genes was carried out successfully in the optimized overexpression E. coli strain M15 [pREP4]. Unfortunately no activity could be detected after testing a number of different substrates. Another project focused on the function of two homologous NRPS genes Pc21g15480 of Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) and NFIA_074300 of N. fischeri. Both genes were amplified from gDNA and successfully cloned into the expression vector pJW24. After protoplastation and transformation of the wildtype Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 with the expression constructs, integration of genes was proven by PCR screening. After extraction of Pc21g15480 transformants, cyclo-L-Trp-L-His was detected by HPLC and NMR analyses. Analysis of the NFIA_074300 transformants revealed, that one transformant produced an additional product peak in comparison to the wildtype. Surprisingly this substance was identified by NMR and MS analyses as pseurotin A, a product of a NRPS/PKS-hybrid and was not the expected substance. In addition, production of secondary metabolites by targeted co-expression of prenyltransferases genes with a NRPS gene was carried out in the dissertation. The genes NFIA_043650 and NFIA_074280, encoding for the prenyltransferases CdpC2PT and CdpC3PT, respectively, were primarily amplified from gDNA and afterwards cloned into the expression construct pCaW34. The expression constructs were transferred into transformant A. nidulans CaW03 (ftmPS). PCR screening of the transformants confirmed the ectopic integration of the prenyltransferase genes into the genome. HPLC analysis revealed clearly product accumulation in the resulted transformants and showed the successful strategy for production of biologically active substances by synthetic biology. Structure elucidation of the isolated products was carried out by NMR and MS analyses.
Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen von nichtribosomalen Peptidsynthetasen und Prenyltransferasen in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten aus Ascomyceten
Mundt,Kathrin
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contents In the course of evolution, microorganisms have developed the ability for production of a multiplicity of structural diverse and complex compounds. Under given environmental conditions, biosynthetic pathways are induced to synthesize complex metabolites that are often toxic toward their competing organisms. Especially production of secondary metabolites of filamentous fungi is one of the most important source of biological active substances, which can be used for the benefit of human health. Notably, the enzyme classes of polyketide synthases (PKS), nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and NRPS/PKS-hybrids are responsible for the production of novel natural products that exhibit considerable therapeutic potential, e.g. antibiotics, antifungal and immunospuppressive drugs. These natural products can be further modified by other enzymes e.g. prenyltransferases, consequently leading to a huge structural diversity. For discovery and development of new drugs, understanding of reaction mechanism of enzymes in nature is mandatory and especially biochemical investigations become more important. In this thesis, functions of two unknown prenyltransferases (FtmPT3, CdpC2PT) of Neosartorya fischeri (N. fischeri) were biochemically identified and characterised. The gene ftmPT3, encodes a prenyltransferase, which catalyses in the presence of DMAPP the prenylation of verruculogen at OH-13 and therefore acts as the long-time missing O-prenyltransferase in the fumitremorgin A biosynthesis. Intensive sequence analyses of ftmPT3 and its adjacent neighbour genes revealed, in comparison to Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), an additional locus with a size of 9.6 kb and seven putative genes. The protein CdpC2PT, shows sequence identities of 40 % with the C2-prenyltransferase BrePT from Aspergillus versicolor and 42 % with NotF from Aspergillus sp. on the amino acid level. Investigations of reaction mixtures of CdpC2PT with DMAPP, showed a broad substrate specifity towards cyclic dipetides with preference for (S)-benzodiazepindione and cyclo-L-Trp-L-Trp. NMR and MS analyses of the enzymatic products revealed unequivocally that CdpC2PT acts as a reverse C2-prenyltransferase and catalyses the mono- and diprenylation of cyclo-L-Trp-L-Trp. Literature search showed the existence of mono- and diprenylated derivatives of cyclo-L-Trp-L-Trp in Penicillium fellutanum (P. fellutanum), socalled fellutanines. Therefore, it can be speculated that CdpC2PT could be involved in the biosynthesis of fellutanines in N. fischeri. Sequence analyses of the neighbour genes revealed the existence of a putative amino oxidase EAW25547, which could be contribute to the biosynthesis of fellutanines. The coding gene NFIA_043660 was successfully amplified from genomic DNA (gDNA) of N. fischeri and subsequently cloned into both expression vectors pQE60 and pHIS8. After incubation under different expression conditions no protein overproduction could be shown. Furthermore, the gene NFIA_062330, encoding for the last unkonwon putative prenyltransferase of N. fischeri, was biochemically investigated. Sequence analyses revealed an orthologous gene ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus), with a sequence identity of 62 % on the amino acid level. Both genes NFIA_062330 and ACLA_042210 were amplified from gDNA and cloned into the expression vector pQE60. Expression of the genes was carried out successfully in the optimized overexpression E. coli strain M15 [pREP4]. Unfortunately no activity could be detected after testing a number of different substrates. Another project focused on the function of two homologous NRPS genes Pc21g15480 of Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) and NFIA_074300 of N. fischeri. Both genes were amplified from gDNA and successfully cloned into the expression vector pJW24. After protoplastation and transformation of the wildtype Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 with the expression constructs, integration of genes was proven by PCR screening. After extraction of Pc21g15480 transformants, cyclo-L-Trp-L-His was detected by HPLC and NMR analyses. Analysis of the NFIA_074300 transformants revealed, that one transformant produced an additional product peak in comparison to the wildtype. Surprisingly this substance was identified by NMR and MS analyses as pseurotin A, a product of a NRPS/PKS-hybrid and was not the expected substance. In addition, production of secondary metabolites by targeted co-expression of prenyltransferases genes with a NRPS gene was carried out in the dissertation. The genes NFIA_043650 and NFIA_074280, encoding for the prenyltransferases CdpC2PT and CdpC3PT, respectively, were primarily amplified from gDNA and afterwards cloned into the expression construct pCaW34. The expression constructs were transferred into transformant A. nidulans CaW03 (ftmPS). PCR screening of the transformants confirmed the ectopic integration of the prenyltransferase genes into the genome. HPLC analysis revealed clearly product accumulation in the resulted transformants and showed the successful strategy for production of biologically active substances by synthetic biology. Structure elucidation of the isolated products was carried out by NMR and MS analyses.
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author Mundt,Kathrin
description Im Laufe der Evolution, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, eine Vielzahl an strukturell vielseitigen und komplexen Substanzen zu bilden. Unter bestimmten Umweltbedingungen werden Biosynthesewege von komplexen Metaboliten induziert, die wiederum oft eine toxische Wirkung gegenüber den konkurrierenden Organismen zeigen. Vor Allem die Sekundärmetabolit-Produktion von filamentösen Pilzen stellt dabei eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar, welche zum Nutzen der menschlichen Gesundheit eingesetzt werden können. Insbesondere die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) und NRPS/PKS-Hybride sind für die Synthese von neuen Naturstoffen verantwortlich, welche großes therapeutisches Potential (Antimykotika, Antibiotika, Immunsuppressiva) besitzen. Die metabolisierten Naturstoffe, können weiterführend durch z.B. Prenyltransferasen modifiziert und somit die Strukturvielfalt enorm gesteigert werden. Für die Entdeckung und Entwicklung neuer Arzneistoffe ist das Verstehen von Reaktionsmechanismen einzelner Enzyme in der Natur zwingend notwendig und dafür sind vor allem biochemische Untersuchungen von großer Bedeutung. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die Funktionen von zwei unbekannten Prenyltransferasen (FtmPT3, CdpC2PT) aus Neosartorya fischeri (N. fischeri) aufgeklärt. Das Gen ftmPT3, codiert für eine Prenyltransferase, welche in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die Prenylierung von Verruculogen an OH-13 katalysiert und somit die lang gesuchte O-Prenyltransferase innerhalb der Fumitremorgin A-Biosynthese darstellt. Intensive Sequenzuntersuchungen zu ftmPT3 und der angrenzenden Nachbargene, wiesen im Vergleich zu Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) einen zusätzlichen Genbereich mit einer Größe von 9,6 kb und sieben Genen auf. Das Protein CdpC2PT, wies Sequenzidentitäten von 40 % mit der C2-Prenyltransferase BrePT aus Aspergillus versicolor und 42 % mit NotF aus Aspergillus sp. auf. Die Analyse der Reaktionsgemische von CdpC2PT mit DMAPP, zeigte die Akzeptanz zyklischer Dipeptide mit Substratpräferenz zu (S)-Benzodiazepindion und cyclo-L-Trp-L-Trp auf. Durch die Analyse der enzymatischen Produkte mittels NMR und MS, konnte CdpC2PT eindeutig als eine reverse C2-Prenyltransferase nachgewiesen werden, welche außerdem die Mono- und Di-Prenylierung von cyclo-L-Trp-L-Trp katalysiert. Literaturrecherche nach bekannten Naturstoffen wies die Existenz von mono- und diprenylierten cyclo-L-Trp-L-Trp Derivaten (Fellutaninen) in Penicillium fellutanum (P. fellutanum) nach und lässt folglich die Beteiligung von CdpC2PT in der Fellutanin-Biosynthese in N. fischeri vermuten. Die Sequenzanalyse der Nachbargene zeigte das Vorhandensein einer putativen Aminooxidase EAW25547 auf, welche in der Fellutanin-Biosynthese mitwirken könnte. Dieses Gen NFIA_043660 wurde aus der genomischen DNA (gDNA) von N. fischeri amplifiziert und in die beiden Expressionsvektoren pQE60 und pHIS8 kloniert. Nach der Untersuchung verschiedener Expressionsbedingungen konnte jedoch keine Proteinüberproduktion festgestellt werden. Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit, die letzte putative Prenyltransferase aus N. fischeri codierend durch NFIA_062330 untersucht. Sequenzanalysen ergaben ein orthologes Gen ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus) mit einer 62 %igen Übereinstimmung auf Aminosäureebene. Die Gene ACLA_042210 und NFIA_062330 konnten jeweils aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. Die Überexpression der Gene wurde erfolgreich in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Stamm E. coli M15 [pREP4] durchgeführt. Für beide Enzyme wurde eine Vielzahl an diversen Substraten getestet, doch leider konnte bisher keine Aktivität nachgewiesen werden. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die homologen NRPS-Gene Pc21g15480 aus Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) und NFIA_074300 aus N. fischeri in vivo funktionell untersucht. Beide Gene wurden erfolgreich aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pJW24 überführt. Nach Protoplastierung und Transformation des Wildtyps Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 mit den Expressionskonstrukten wurde die Integration der Gene für einige Transformanten mittels PCR-Screening nachgewiesen. Nach Extraktion der Kulturen der Pc21g15480-Transformanten konnte die deutliche Akkumulation zweier neuer Substanzen im Vergleich zum Wildtyp A. nidulans TN02A7 beobachtet werden. Nach Isolierung des ersten Produktes konnte mittels NMR- und MS-Analysen cyclo-L-Trp-L-His nachgewiesen werden. Die Untersuchung der NFIA_074300-Transformanten zeigte hingegen nur einen Transformanten mit einer zusätzlichen Produktbildung im Vergleich zu A. nidulans TN02A7 auf. Diese Substanz wurde mittels NMR und MS überraschenderweise als das PKS/NRPS-Produkt Pseurotin A identifiziert werden und stellte nicht die erwartete Substanz dar. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit der gezielten Koexpression der Prenyltransferasegene cdpC2PT oder cdpC3PT mit dem NRPS-Gen ftmPS aus N. fischeri. Die codierenden Gene NFIA_043650 und NFIA_074280 wurden nach der entsprechenden Amplifikation in das Expressionskonstrukt pCaW34 eingebracht. Nach der in vivo Synthese von cyclo-L-Trp-L-Pro (Brevianamid F) durch die NRPS FtmPS, wurden die Expressionskonstrukte in den Transformanten A. nidulans CaW03 (ftmPS) eingebracht. Die ektopische Integration der Gene wurde durch PCR-Screening der erhaltenen Transformanten bestätigt. Die Analyse der Sekundärstoffproduktion mittels HPLC zeigte, eine deutliche Produktbildung in den einzelnen Transformanten auf.
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For discovery and development of new drugs, understanding of reaction mechanism of enzymes in nature is mandatory and especially biochemical investigations become more important. In this thesis, functions of two unknown prenyltransferases (FtmPT3, CdpC2PT) of Neosartorya fischeri (N. fischeri) were biochemically identified and characterised. The gene ftmPT3, encodes a prenyltransferase, which catalyses in the presence of DMAPP the prenylation of verruculogen at OH-13 and therefore acts as the long-time missing O-prenyltransferase in the fumitremorgin A biosynthesis. Intensive sequence analyses of ftmPT3 and its adjacent neighbour genes revealed, in comparison to Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), an additional locus with a size of 9.6 kb and seven putative genes. The protein CdpC2PT, shows sequence identities of 40 % with the C2-prenyltransferase BrePT from Aspergillus versicolor and 42 % with NotF from Aspergillus sp. on the amino acid level. Investigations of reaction mixtures of CdpC2PT with DMAPP, showed a broad substrate specifity towards cyclic dipetides with preference for (S)-benzodiazepindione and cyclo-L-Trp-L-Trp. NMR and MS analyses of the enzymatic products revealed unequivocally that CdpC2PT acts as a reverse C2-prenyltransferase and catalyses the mono- and diprenylation of cyclo-L-Trp-L-Trp. Literature search showed the existence of mono- and diprenylated derivatives of cyclo-L-Trp-L-Trp in Penicillium fellutanum (P. fellutanum), socalled fellutanines. Therefore, it can be speculated that CdpC2PT could be involved in the biosynthesis of fellutanines in N. fischeri. Sequence analyses of the neighbour genes revealed the existence of a putative amino oxidase EAW25547, which could be contribute to the biosynthesis of fellutanines. The coding gene NFIA_043660 was successfully amplified from genomic DNA (gDNA) of N. fischeri and subsequently cloned into both expression vectors pQE60 and pHIS8. After incubation under different expression conditions no protein overproduction could be shown. Furthermore, the gene NFIA_062330, encoding for the last unkonwon putative prenyltransferase of N. fischeri, was biochemically investigated. Sequence analyses revealed an orthologous gene ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus), with a sequence identity of 62 % on the amino acid level. Both genes NFIA_062330 and ACLA_042210 were amplified from gDNA and cloned into the expression vector pQE60. Expression of the genes was carried out successfully in the optimized overexpression E. coli strain M15 [pREP4]. Unfortunately no activity could be detected after testing a number of different substrates. Another project focused on the function of two homologous NRPS genes Pc21g15480 of Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) and NFIA_074300 of N. fischeri. Both genes were amplified from gDNA and successfully cloned into the expression vector pJW24. After protoplastation and transformation of the wildtype Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 with the expression constructs, integration of genes was proven by PCR screening. After extraction of Pc21g15480 transformants, cyclo-L-Trp-L-His was detected by HPLC and NMR analyses. Analysis of the NFIA_074300 transformants revealed, that one transformant produced an additional product peak in comparison to the wildtype. Surprisingly this substance was identified by NMR and MS analyses as pseurotin A, a product of a NRPS/PKS-hybrid and was not the expected substance. In addition, production of secondary metabolites by targeted co-expression of prenyltransferases genes with a NRPS gene was carried out in the dissertation. The genes NFIA_043650 and NFIA_074280, encoding for the prenyltransferases CdpC2PT and CdpC3PT, respectively, were primarily amplified from gDNA and afterwards cloned into the expression construct pCaW34. The expression constructs were transferred into transformant A. nidulans CaW03 (ftmPS). PCR screening of the transformants confirmed the ectopic integration of the prenyltransferase genes into the genome. HPLC analysis revealed clearly product accumulation in the resulted transformants and showed the successful strategy for production of biologically active substances by synthetic biology. Structure elucidation of the isolated products was carried out by NMR and MS analyses. opus:5322 urn:nbn:de:hebis:04-z2014-00310 2013 Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen von nichtribosomalen Peptidsynthetasen und Prenyltransferasen in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten aus Ascomyceten 2015-01-14 Im Laufe der Evolution, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, eine Vielzahl an strukturell vielseitigen und komplexen Substanzen zu bilden. Unter bestimmten Umweltbedingungen werden Biosynthesewege von komplexen Metaboliten induziert, die wiederum oft eine toxische Wirkung gegenüber den konkurrierenden Organismen zeigen. Vor Allem die Sekundärmetabolit-Produktion von filamentösen Pilzen stellt dabei eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar, welche zum Nutzen der menschlichen Gesundheit eingesetzt werden können. Insbesondere die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) und NRPS/PKS-Hybride sind für die Synthese von neuen Naturstoffen verantwortlich, welche großes therapeutisches Potential (Antimykotika, Antibiotika, Immunsuppressiva) besitzen. Die metabolisierten Naturstoffe, können weiterführend durch z.B. Prenyltransferasen modifiziert und somit die Strukturvielfalt enorm gesteigert werden. Für die Entdeckung und Entwicklung neuer Arzneistoffe ist das Verstehen von Reaktionsmechanismen einzelner Enzyme in der Natur zwingend notwendig und dafür sind vor allem biochemische Untersuchungen von großer Bedeutung. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die Funktionen von zwei unbekannten Prenyltransferasen (FtmPT3, CdpC2PT) aus Neosartorya fischeri (N. fischeri) aufgeklärt. Das Gen ftmPT3, codiert für eine Prenyltransferase, welche in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die Prenylierung von Verruculogen an OH-13 katalysiert und somit die lang gesuchte O-Prenyltransferase innerhalb der Fumitremorgin A-Biosynthese darstellt. Intensive Sequenzuntersuchungen zu ftmPT3 und der angrenzenden Nachbargene, wiesen im Vergleich zu Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) einen zusätzlichen Genbereich mit einer Größe von 9,6 kb und sieben Genen auf. Das Protein CdpC2PT, wies Sequenzidentitäten von 40 % mit der C2-Prenyltransferase BrePT aus Aspergillus versicolor und 42 % mit NotF aus Aspergillus sp. auf. Die Analyse der Reaktionsgemische von CdpC2PT mit DMAPP, zeigte die Akzeptanz zyklischer Dipeptide mit Substratpräferenz zu (S)-Benzodiazepindion und cyclo-L-Trp-L-Trp auf. Durch die Analyse der enzymatischen Produkte mittels NMR und MS, konnte CdpC2PT eindeutig als eine reverse C2-Prenyltransferase nachgewiesen werden, welche außerdem die Mono- und Di-Prenylierung von cyclo-L-Trp-L-Trp katalysiert. Literaturrecherche nach bekannten Naturstoffen wies die Existenz von mono- und diprenylierten cyclo-L-Trp-L-Trp Derivaten (Fellutaninen) in Penicillium fellutanum (P. fellutanum) nach und lässt folglich die Beteiligung von CdpC2PT in der Fellutanin-Biosynthese in N. fischeri vermuten. Die Sequenzanalyse der Nachbargene zeigte das Vorhandensein einer putativen Aminooxidase EAW25547 auf, welche in der Fellutanin-Biosynthese mitwirken könnte. Dieses Gen NFIA_043660 wurde aus der genomischen DNA (gDNA) von N. fischeri amplifiziert und in die beiden Expressionsvektoren pQE60 und pHIS8 kloniert. Nach der Untersuchung verschiedener Expressionsbedingungen konnte jedoch keine Proteinüberproduktion festgestellt werden. Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit, die letzte putative Prenyltransferase aus N. fischeri codierend durch NFIA_062330 untersucht. Sequenzanalysen ergaben ein orthologes Gen ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus) mit einer 62 %igen Übereinstimmung auf Aminosäureebene. Die Gene ACLA_042210 und NFIA_062330 konnten jeweils aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. Die Überexpression der Gene wurde erfolgreich in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Stamm E. coli M15 [pREP4] durchgeführt. Für beide Enzyme wurde eine Vielzahl an diversen Substraten getestet, doch leider konnte bisher keine Aktivität nachgewiesen werden. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die homologen NRPS-Gene Pc21g15480 aus Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) und NFIA_074300 aus N. fischeri in vivo funktionell untersucht. Beide Gene wurden erfolgreich aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pJW24 überführt. Nach Protoplastierung und Transformation des Wildtyps Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 mit den Expressionskonstrukten wurde die Integration der Gene für einige Transformanten mittels PCR-Screening nachgewiesen. Nach Extraktion der Kulturen der Pc21g15480-Transformanten konnte die deutliche Akkumulation zweier neuer Substanzen im Vergleich zum Wildtyp A. nidulans TN02A7 beobachtet werden. Nach Isolierung des ersten Produktes konnte mittels NMR- und MS-Analysen cyclo-L-Trp-L-His nachgewiesen werden. Die Untersuchung der NFIA_074300-Transformanten zeigte hingegen nur einen Transformanten mit einer zusätzlichen Produktbildung im Vergleich zu A. nidulans TN02A7 auf. Diese Substanz wurde mittels NMR und MS überraschenderweise als das PKS/NRPS-Produkt Pseurotin A identifiziert werden und stellte nicht die erwartete Substanz dar. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit der gezielten Koexpression der Prenyltransferasegene cdpC2PT oder cdpC3PT mit dem NRPS-Gen ftmPS aus N. fischeri. Die codierenden Gene NFIA_043650 und NFIA_074280 wurden nach der entsprechenden Amplifikation in das Expressionskonstrukt pCaW34 eingebracht. Nach der in vivo Synthese von cyclo-L-Trp-L-Pro (Brevianamid F) durch die NRPS FtmPS, wurden die Expressionskonstrukte in den Transformanten A. nidulans CaW03 (ftmPS) eingebracht. Die ektopische Integration der Gene wurde durch PCR-Screening der erhaltenen Transformanten bestätigt. Die Analyse der Sekundärstoffproduktion mittels HPLC zeigte, eine deutliche Produktbildung in den einzelnen Transformanten auf. 2013-12-18 Molecular biological and biochemical analyses of nonribosomal peptidesynthetases and prenyltransferases in the biosynthesis of secondary metabolites of ascomycetes http://dx.doi.org/10.17192/z2014.0031 Mundt,Kathrin Philipps-Universität Marburg ths Prof. Dr. Li Shu-Ming Li, Shu-Ming (Prof. Dr.)
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