application/pdf Proteinogene Aminosäuren Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Zaprasis, Adrienne Zaprasis Adrienne Prolin als osmotische Schutzsubstanz und Nahrungsquelle 2013-04-04 https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2013/0717/cover.png doctoralThesis opus:4930 German 2013 Fachbereich Biologie https://doi.org/10.17192/z2013.0717 urn:nbn:de:hebis:04-z2013-07176 Proline is a very important compound and serves several functions for the gram+ bacterium Bacillus subtilis. Prolin is an amino acid and therefore essential for protein synthesis, it can be used by B. subtilis as a single source of carbon and nitrogen and furthermore proline acts as an osmostress protectant. B. subtilis possess two different ways for the de novo synthesis of proline: the anabolic and the osmoadaptive pathway. Both pathways are connected via the shared ProA protein. The deletion of the proA gene leads to a perturbation in both the anabolic and osmoadaptive proline biosynthesis. Suppressor mutations within the rocR-rocDEF region recruit the arginine degradation pathway for the synthesis of proline. The suppressor mutations were of two types: (i) single amino acid substitutions in the activator protein RocR resulting in partial inducer-independent RocR* variants; (ii) mutants in the promoter region of rocDEF activates a cryptic SigA-type promoter. Both types of mutants enhance the transcription of rocDEF leading to increased amounts of RocD. RocD as part of the arginine degradation pathway synthesizes the same reaction product as the ProA enzyme and thereby bypassing the ProA mediated enzyme reaction. Furthermore, the suppressor mutants also developed a new regulatory mechanism that allows the enhanced rocDEF transcription in response to proline in the presence of ammonium. This demonstrates how effective bacteria can adapt to limitations on their essential biosynthetic pathways. In his natural habitat B. subtilis is frequently exposed to osmotic fluctuations. B. subtilis can adapt to high osmolarity growth conditions through the osmotically induced de novo synthesis or the uptake of proline. But B. subtilis can also use proline containing peptides as osmostress protectants. Osmoprotection by peptides depends on their import via peptide uptake systems (App, Dpp, Opp, DtpT) and the subsequent hydrolysis to release proline. The liberated proline is then accumulated to protect the cell against the disadvantageous effects of high osmolarity. The peptidases responsible for the hydrolysis of various types of Xaa-Pro and Xaa-Pro-Xaa peptides could be identified: PapA (YqhT) and PapB (YkvY). This adds a new aspect to the use of proline as an osmostress protectant by B. subtilis and demonstrates how gainful available resources can be used by bacteria to adapt to changes in environmental conditions. In addition to PutP and OpuE, B. subtilis possess a so far uncharacterized proline transport system. To identify the unknown proline transporter a genetic screening approach was developed. In a B. subtilis mutant strain unable to transport proline, the transcription of the proline utilization genes (putBCP) did no longer occur in the presence of proline. This demonstrates the necessity of the proline import to induce putBCP expression. In conclusion, the knowledge acquired in this dissertation revealed novel facets of the physiological role of proline in B. subtilis and furthermore it illustrates impressively how effective bacteria can adapt on a variety of changing. In dem Gram+ Bakterium Bacillus subtilis spielt Prolin eine wichtige Rolle. Als proteinogene Aminosäure ist es essentiell für die Biosynthese von Proteinen, es findet als Kohlen- oder Stickstoffquelle Verwendung und es fungiert außerdem als osmotische Schutzsubstanz. B. subtilis besitzt zwei Wege um Prolin de novo zu synthetisieren: die anabole und die osmoadaptive Prolinbiosynthese. Beide Wege sind über das gemeinsam genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Die Deletion von proA führt zu einer Störung in der Prolinbiosynthese. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Suppressor-Mutationen innerhalb der rocR-rocDEF-Region diese Störung durch die Rekrutierung des Argininabbau-Weges für die Prolin Neusynthese ausgleichen können. Zwei Klassen von Mutationen konnten identifiziert werden: (i) einzelner Aminosäureaustausch im Aktivatorprotein RocR führt zu teilweise Induktor unabhängigen RocR*-Proteinen; (ii) Mutationen in der Promotorregion von rocDEF führen zur Aktivierung eines kryptischen SigA-abhängigen Promotors. In beiden Fällen kam es zu einer erhöhten Transkription des rocDEF-Operons, was die Erhöhung der Menge an RocD in der Zelle zur Folge hatte. RocD als Teil des Argininabbau-Weges produziert dabei dasselbe Produkt wie ProA und kann somit dessen Fehlen ersetzen. Außerdem entwickelte sich dabei ein völlig neuer regulatorischer Mechanismus für die Expression des rocDEF-Operons, da dessen Expression nun auch in Anwesenheit von Ammonium durch Prolin induziert werden konnte. Dies demonstriert wie effektiv sich Bakterien an Einschränkungen innerhalb essentieller Stoffwechselwege anpassen können. In seinem natürlichen Habitat ist B. subtilis ständig wechselnden Umweltbedingungen, wie die Osmolarität, ausgesetzt. Die Anpassung an hochosmolare Bedingungen erfolgt dabei durch die osmotisch kontrollierte de novo Synthese von Prolin, oder durch dessen Aufnahme aus der Umgebung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass prolinhaltige Peptide ebenfalls eine osmoprotektive Wirkung besitzen. Nach dem Import der Peptide durch spezielle Peptidtransporter (App, Dpp, Opp, DtpT) kommt es intrazellulär zu deren Spaltung, was zu einer Freisetzung des Prolins führt. Durch die Akkumulation dieses Prolins kommt es zu einem Schutz der osmotisch gestressten Zelle. Die an der Spaltung der Xaa-Pro bzw. Xaa-Pro-Xaa Peptide beteiligten Peptidasen konnten identifiziert werden: PapA (YqhT) und PapB (YkvY). Dies fügt einen neuen Aspekt in der Nutzung von Prolin als osmotische Schutzsubstanz durch B. subtilis hinzu und demonstriert wie gewinnbringend die im Habitat verfügbaren Ressourcen zum Schutz vor osmotischem Stress genutzt werden können. B. subtilis besitzt neben den beiden bekannten Prolintransportern (PutP, OpuE) noch ein weiteres, bisher unbekanntes Prolinaufnahmesystem. In dieser Arbeit wurde für dessen Identifizierung ein genetisches Screening-Verfahren entwickelt. In einem Stamm der Prolin nicht mehr aktiv in die Zelle aufnehmen kann, wurden trotz externer Zugabe von Prolin die Gene des Prolinabbau-Weges (putBCP) nicht mehr exprimiert. Dies demonstriert, dass der Import des externen Prolins in die Zelle, die Voraussetzung für die Induktion der Transkription von putBCP ist. Die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse enthüllen weitere Facetten der physiologischen Rolle von Prolin in B. subtilis und zeigen außerdem sehr eindrucksvoll, wie effektiv sich Bakterien an die unterschiedlichsten Veränderungen anpassen können. Philipps-Universität Marburg Biologie 2013-12-18 monograph Protein Syntheses Proline as an osmostress protectant and as a nutrient source Life sciences Biowissenschaften, Biologie ppn:334797748 ths Prof. Dr. Bremer Erhard Bremer, Erhard (Prof. Dr.) 2013-12-18