2013-12-10 2013 application/pdf Mikroskopie Life-cell microscopy Philipps-Universität Marburg Investigations on the intracellular transport mechanism of Marbugvius nucleocapsids ppn:334566436 doctoralThesis opus:5278 urn:nbn:de:hebis:04-z2013-07069 Untersuchungen zum intrazellulären Transportmechanismus von Marburgvirus Nukleokapsiden GFP Schudt, Gordian Schudt Gordian Aktin Medizin VP30 VP40 German monograph Medizin 2013-12-10 Lebendzellmikroskopie 2013-12-03 Marburgvirus together with Ebolavirus constitute the family of Filoviridae. Both viruses possess a non-segmented single strand RNA genome in negative orientation and therefore belong to the order Mononegavirales. Marburgvirus causes severe hemorrhagic fever with high case fatality rates in humans and non-human primates. Seven genes are encoded by the viral ge-nome, five of the gene products, the nucleoprotein NP, the viral proteins VP24, VP30 and VP35 together with the polymerase L form the nucleocapsid. The nucleocapsid is surrounded by the matrix protein VP40 which connects the nucleocapsid with the lipid bilayer in which the glyco-protein GP is inserted. Viral replication takes place in the cytoplasm. This doctoral thesis inves-tigated the intracellular transport of nucleocapsids. Analyses were based on molecular biologi-cal and imaging techniques, mainly live-cell imaging, accompanied by confocal microscopy and scanning electron microscopy. To generate a fluorescently labeled Marburgvirus, a reverse genetic system was used to integrate an additional open reading frame into the viral genome, coding for a red fluorescently labeled VP40 (RFP-VP40). The constructed genome was used to rescue a recombinant Marburg virus (rMARVRFP-VP40) which expressed the fluorescent VP40. Expressing a green fluorescent VP30 (VP30GFP) in cells infected with rMARVRFP-VP40 both, the nucleocapsid and the matrix protein could be visualized in order to study their transport and interaction. By dual-color imaging, virally-induced inclusions were identified as the origin of new nucleocapsids that were transported to the plasma membrane. Although VP40 was re-cruited into inclusions, no detectable amount of VP40 was detected in freshly released nucle-ocapsids. Once released into the cytoplasm, nucleocapsids were transported in a seemingly random actin-based long-distance transport at speeds between 200 and 500 nm/s. Microtu-bules were not essential for the intracellular movement of Marburg virus nucleocapsids. Once nucleocapsids reached the cell periphery, movement slows down to ± 100 nm/s. At the plasma membrane, nucleocapsid became associated with the matrix protein which was a prerequisite for the subsequent exit process. Interaction of the matrix protein with the nucleocapsids is supported by Tyrosine phosphorylation of VP40 and also enables the recruitment of nucle-ocapsids into filopodia. Inside filopodia nucleocapsids were cotransported with an actin-based motor protein, Myosin 10. virology Virologie Medical sciences Medicine Medizin https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2013/0706/cover.png actin Marburgvirus Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg cytosceleton ths Pof. Dr. Becker Stephan Becker, Stephan (Pof. Dr.) https://doi.org/10.17192/z2013.0706 GFP Das Marburgvirus bildet zusammen mit dem Ebolavirus die Familie der Filoviridae. Beide Viren lösen beim Menschen und bei nicht-menschlichen Primaten ein starkes hämorrhagisches Fie-ber mit hoher Sterblichkeitsrate aus. Die Viren besitzen ein einzelsträngiges, nicht-segmentiertes RNA-Genom in negativer Orientierung und gehören somit in die Ordnung der Mononegavirales. Die RNA codiert für sieben virale Strukturproteine, von denen fünf das Ge-nom enkapsidieren: das Nukleoprotein NP, die viralen Proteine VP24, VP30 und VP35 sowie die Polymerase L. VP40 umgibt als Matrixprotein den als Nukleokapsid bezeichneten Komplex. In die Lipidhülle, die das längliche Virus umgibt, ist das Glykoprotein GP inseriert. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem intrazellulären Transport von Nukleokapsiden in der Marburgvirus-infizierten Zelle. In erster Linie wurde hierfür die Methode der Lebendzellmikroskopie ver-wendet, die von konfokaler Mikroskopie und Scanning Elektronenmikroskopie ergänzt wurde. Durch ein reverses Marburgvirus-spezifisches Genetiksystem wurde ein zusätzlicher Leserah-men für ein rot markiertes VP40 in das virale Genom integriert und ein rekombinantes Virus hergestellt (rMARVRFP-VP40). In Kombination mit der Plasmid-gestützten Expression von grün fluoreszierenden VP30 (VP30GFP) konnte in rMARVRFP-VP40-infizierten Zellen, neben dem Mat-rixprotein auch das Nukleokapsid sichtbar gemacht werden. Die Zweifarbmarkierung erlaubte es, sogenannte Inclusions als den Ursprungsort von neu gebildeten Nukleokapsiden zu identi-fizieren. Obwohl VP40 in Inclusions vorliegt, tragen neugebildete Nukleokapside nach Freiset-zung aus den Einschlusskörpern keine detektierbare Menge des Matrixproteins. Nukleokapsi-de werden in einem scheinbar zufällig ablaufenden, aktinbasierten Langstreckentransport mit Geschwindigkeiten zwischen 200 und 500 nm/s entlang von Aktinfilamenten transportiert. Nach einem mehrere Mikrometer langen Transportweg verlangsamen Nukleokapside ihre Bewegung auf ca. 100 nm/s und an der Plasmamembran treffen Matrixprotein und Nukleoka-pside aufeinander. Es kommt zur dynamischen Assoziation mit dem Matrixprotein, die von der Phosphorylierung des Matrixproteins an Tyrosinresten abhängig ist. Die Assoziation der Nuk-leokapside mit dem Matrixprotein ist erforderlich für den Austrittsprozess der Viren. Mar-burgviren nutzen längliche Zellausläufer (Filopodien), um die Zelle zu verlassen. Die Nukleo-kapside werden in den Filopodien gemeinsam mit Myosin 10 entlang von Aktinbündeln transportiert.