Neue Gentargeting-Strategien auf Basis der RNA interference RNAi

RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradat...

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1. Verfasser: Werth, Stephanie
Beteiligte: Aigner, Achim (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2013
Pharmakologie und Toxikologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0456
Schlagworte:
PTN
PEI
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Biowissenschaften, Biologie
Polyethylenimin
PTN
Vascular endothelial Growth Factor
RNS-Interferenz
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Werth, Stephanie
Neue Gentargeting-Strategien auf Basis der RNA interference RNAi
RNA interference is a natural process in eukaryotic cells leading to the specific down-regulation of gene expression (gene silencing). The mechanism of RNAi is mediated through 21-23 nt long double-stranded RNA molecules (siRNA) which sequence-specifically induce the degradation of their target-mRNA. One critical factor that determines the success of RNAi is the rapid degradation of nucleic acids by ribonucleases and reduced transfection efficiency. Polyethylenimines are synthetic polymers which are present in different molecular weights and which have a high cationic charge density. Due to their protonation they are able to form complexes with DNA or siRNA. As positively charged polyplexes they interact with the cell membrane and are absorbed by endocytosis into the cytosol. By fractionation of a commercially available 25kDa PEI using gel permeation chromatography, a low molecular weight polyethylenimine (F25-LMW-PEI) with superior transfection efficacy and low toxicity in the cell lines SKOV3, U87 and PC3 was obtained. Upon lyophilization and reconstitution of F25-LMW-PEI/siRNA/DNA complexes, siRNAs are still able to efficiently induce RNAi. To further demonstrate their applicability, lyophilized PEI/siRNA complexes are employed for targeting the growth factors VEGF and PTN. Treatment of the PC3 prostate carcinoma cells or U87 glioblastoma cells with fresh or with lyophilized complexes results in decreased cell proliferation in different assays due to the siRNA-mediated downregulation of VEGF and PTN. In conclusion, siRNAs can be applied in lyophilizes formulations, and lyophilized F25-LMW-PEI-based siRNA complexes represent a powerful, inexpensive, non-toxic and simple ready-to-use platform for the specific and efficient targeting of genes in vitro.
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contents RNA interference is a natural process in eukaryotic cells leading to the specific down-regulation of gene expression (gene silencing). The mechanism of RNAi is mediated through 21-23 nt long double-stranded RNA molecules (siRNA) which sequence-specifically induce the degradation of their target-mRNA. One critical factor that determines the success of RNAi is the rapid degradation of nucleic acids by ribonucleases and reduced transfection efficiency. Polyethylenimines are synthetic polymers which are present in different molecular weights and which have a high cationic charge density. Due to their protonation they are able to form complexes with DNA or siRNA. As positively charged polyplexes they interact with the cell membrane and are absorbed by endocytosis into the cytosol. By fractionation of a commercially available 25kDa PEI using gel permeation chromatography, a low molecular weight polyethylenimine (F25-LMW-PEI) with superior transfection efficacy and low toxicity in the cell lines SKOV3, U87 and PC3 was obtained. Upon lyophilization and reconstitution of F25-LMW-PEI/siRNA/DNA complexes, siRNAs are still able to efficiently induce RNAi. To further demonstrate their applicability, lyophilized PEI/siRNA complexes are employed for targeting the growth factors VEGF and PTN. Treatment of the PC3 prostate carcinoma cells or U87 glioblastoma cells with fresh or with lyophilized complexes results in decreased cell proliferation in different assays due to the siRNA-mediated downregulation of VEGF and PTN. In conclusion, siRNAs can be applied in lyophilizes formulations, and lyophilized F25-LMW-PEI-based siRNA complexes represent a powerful, inexpensive, non-toxic and simple ready-to-use platform for the specific and efficient targeting of genes in vitro.
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description RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradation ihrer Ziel-mRNA herbeiführen, indem sie den RISC-Komplex im Zytosol zu seiner Ziel-mRNA dirigieren. Ein Kriterium bei der Transfektion der Zellen mit siRNA ist der schnelle Abbau der Nukleinsäuren durch Ribonukleasen und damit eine verminderte Transfektionseffizienz. Polyethylenimine sind synthetische Polymere, die in verschiedenen Molmassen vorliegen und die eine hohe kationische Ladungsdichte aufweisen. Aufgrund dieser Protonierung sind sie in der Lage, Komplexe mit siRNA oder DNA zu bilden. Als positiv geladene Polyplexe interagieren sie dann mit der Zellmembran und werden per Endozytose in das Zytosol aufgenommen. Die Pufferkapazität der Polyethylenimine ermöglicht das Verlassen der Lyosomen nach deren Platzen (Protonenschwammhypothese) und schützt die Nukleinsäuren vor der Degradation. In dieser Arbeit wurde die gelpermeationschromatographische Trennung der Lösung eines verzweigten 25-kDa-Polyethylenimins zur Herstellung eines Low molecular weight Polyethylenimins genutzt. Dieses als F25-LMW-PEI bezeichnete Polyethylenimin zeigte eine verbesserte Transfektionseffizienz sowie eine geringere Zytotoxizität, die bei Transfektionsversuchen mit den Zelllinien SKOV3, U87 und PC3 näher untersucht wurden. Hier konnten bei Co-Transfektionen mit DNA hervorragende Transfektionseigenschaften nachgewiesen werden. Gleichfalls war die durch siRNA vermittelte Herunterregulation der Luciferase bei stabil Luciferase-exprimierenden SKOV3-10-Zellen unter verschiedenen Transfektionsbedingungen eindeutig nachweisbar. Auch nach Lyophilisierung und Resolubilisierung der PEI/siRNA/DNA-Komplexe konnte ein Genknockdown durch RNAi beobachtet werden. Zur weiteren Charakterisierung des F25-LMW-PEI-vermittelten siRNA-Targetings tumorrelevanter Genprodukte wurden die Prostatakarzinomzelllinie PC3 sowie die Glioblastomzelllinie U87 verwendet. Die Prostatakarzinomzellen PC3 exprimieren den wichtigen Angiogenese-Faktor VEGF, welcher vermehrt beim Tumorwachstum und der damit verbundenen Angiogenese nachgewiesen wird. Eine Vielzahl von Krebsarten geht mit einer erhöhten VEGF-mRNA-Expression einher. Die Möglichkeit des wirkungsvollen siRNA-Targetings und des Knockdowns wurde durch ein vermindertes PC3-Zellwachstum im WST-Assay dargestellt. U87-Zellen exprimieren den Heparin-bindenden Wachstumsfaktor Pleiotrophin (PTN), welcher vermehrt bei bösartigen Erkrankungen gefunden wird. Die protoonkogene Wirkung des PTN-Gens beruht hauptsächlich auf der Stimulation der Proliferation von Tumorzellen und der Angiogenese. Bei den U87-Zellen konnte bei den mit der spezifischen PTN-siRNA transfizierten Zellen eine PTN-Herunterregulation auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden, was zu einer verminderten Zellproliferation führte. Die Möglichkeit der Lyophilisierung der F25-LMW-PEI/siRNA-Komplexe war auch bei Transfektion der PC3- sowie der U87-Zellen eindeutig nachweisbar und es zeigten sich nach der Transfektion mit den spezifischen siRNAs ein vermindertes Zellwachstum der malignen Zellen sowie eine verminderte Konzentration von PTN auf Proteinebene.
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As positively charged polyplexes they interact with the cell membrane and are absorbed by endocytosis into the cytosol. By fractionation of a commercially available 25kDa PEI using gel permeation chromatography, a low molecular weight polyethylenimine (F25-LMW-PEI) with superior transfection efficacy and low toxicity in the cell lines SKOV3, U87 and PC3 was obtained. Upon lyophilization and reconstitution of F25-LMW-PEI/siRNA/DNA complexes, siRNAs are still able to efficiently induce RNAi. To further demonstrate their applicability, lyophilized PEI/siRNA complexes are employed for targeting the growth factors VEGF and PTN. Treatment of the PC3 prostate carcinoma cells or U87 glioblastoma cells with fresh or with lyophilized complexes results in decreased cell proliferation in different assays due to the siRNA-mediated downregulation of VEGF and PTN. In conclusion, siRNAs can be applied in lyophilizes formulations, and lyophilized F25-LMW-PEI-based siRNA complexes represent a powerful, inexpensive, non-toxic and simple ready-to-use platform for the specific and efficient targeting of genes in vitro. New gene targeting strategies based on RNAi 2013-08-21 RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradation ihrer Ziel-mRNA herbeiführen, indem sie den RISC-Komplex im Zytosol zu seiner Ziel-mRNA dirigieren. Ein Kriterium bei der Transfektion der Zellen mit siRNA ist der schnelle Abbau der Nukleinsäuren durch Ribonukleasen und damit eine verminderte Transfektionseffizienz. Polyethylenimine sind synthetische Polymere, die in verschiedenen Molmassen vorliegen und die eine hohe kationische Ladungsdichte aufweisen. Aufgrund dieser Protonierung sind sie in der Lage, Komplexe mit siRNA oder DNA zu bilden. Als positiv geladene Polyplexe interagieren sie dann mit der Zellmembran und werden per Endozytose in das Zytosol aufgenommen. Die Pufferkapazität der Polyethylenimine ermöglicht das Verlassen der Lyosomen nach deren Platzen (Protonenschwammhypothese) und schützt die Nukleinsäuren vor der Degradation. In dieser Arbeit wurde die gelpermeationschromatographische Trennung der Lösung eines verzweigten 25-kDa-Polyethylenimins zur Herstellung eines Low molecular weight Polyethylenimins genutzt. Dieses als F25-LMW-PEI bezeichnete Polyethylenimin zeigte eine verbesserte Transfektionseffizienz sowie eine geringere Zytotoxizität, die bei Transfektionsversuchen mit den Zelllinien SKOV3, U87 und PC3 näher untersucht wurden. Hier konnten bei Co-Transfektionen mit DNA hervorragende Transfektionseigenschaften nachgewiesen werden. Gleichfalls war die durch siRNA vermittelte Herunterregulation der Luciferase bei stabil Luciferase-exprimierenden SKOV3-10-Zellen unter verschiedenen Transfektionsbedingungen eindeutig nachweisbar. Auch nach Lyophilisierung und Resolubilisierung der PEI/siRNA/DNA-Komplexe konnte ein Genknockdown durch RNAi beobachtet werden. Zur weiteren Charakterisierung des F25-LMW-PEI-vermittelten siRNA-Targetings tumorrelevanter Genprodukte wurden die Prostatakarzinomzelllinie PC3 sowie die Glioblastomzelllinie U87 verwendet. Die Prostatakarzinomzellen PC3 exprimieren den wichtigen Angiogenese-Faktor VEGF, welcher vermehrt beim Tumorwachstum und der damit verbundenen Angiogenese nachgewiesen wird. Eine Vielzahl von Krebsarten geht mit einer erhöhten VEGF-mRNA-Expression einher. Die Möglichkeit des wirkungsvollen siRNA-Targetings und des Knockdowns wurde durch ein vermindertes PC3-Zellwachstum im WST-Assay dargestellt. U87-Zellen exprimieren den Heparin-bindenden Wachstumsfaktor Pleiotrophin (PTN), welcher vermehrt bei bösartigen Erkrankungen gefunden wird. Die protoonkogene Wirkung des PTN-Gens beruht hauptsächlich auf der Stimulation der Proliferation von Tumorzellen und der Angiogenese. Bei den U87-Zellen konnte bei den mit der spezifischen PTN-siRNA transfizierten Zellen eine PTN-Herunterregulation auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden, was zu einer verminderten Zellproliferation führte. Die Möglichkeit der Lyophilisierung der F25-LMW-PEI/siRNA-Komplexe war auch bei Transfektion der PC3- sowie der U87-Zellen eindeutig nachweisbar und es zeigten sich nach der Transfektion mit den spezifischen siRNAs ein vermindertes Zellwachstum der malignen Zellen sowie eine verminderte Konzentration von PTN auf Proteinebene. ths Prof. Dr. Aigner Achim Aigner, Achim (Prof. Dr.) Werth, Stephanie Werth Stephanie Philipps-Universität Marburg
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