Neue Gentargeting-Strategien auf Basis der RNA interference RNAi

RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradat...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Werth, Stephanie
Beteiligte: Aigner, Achim (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2013
Pharmakologie und Toxikologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0456
Schlagworte:
PTN
PEI
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:RNA Interferenz ist ein natürlicher Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt. Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche sequenzspezifisch den Abbau und die Degradation ihrer Ziel-mRNA herbeiführen, indem sie den RISC-Komplex im Zytosol zu seiner Ziel-mRNA dirigieren. Ein Kriterium bei der Transfektion der Zellen mit siRNA ist der schnelle Abbau der Nukleinsäuren durch Ribonukleasen und damit eine verminderte Transfektionseffizienz. Polyethylenimine sind synthetische Polymere, die in verschiedenen Molmassen vorliegen und die eine hohe kationische Ladungsdichte aufweisen. Aufgrund dieser Protonierung sind sie in der Lage, Komplexe mit siRNA oder DNA zu bilden. Als positiv geladene Polyplexe interagieren sie dann mit der Zellmembran und werden per Endozytose in das Zytosol aufgenommen. Die Pufferkapazität der Polyethylenimine ermöglicht das Verlassen der Lyosomen nach deren Platzen (Protonenschwammhypothese) und schützt die Nukleinsäuren vor der Degradation. In dieser Arbeit wurde die gelpermeationschromatographische Trennung der Lösung eines verzweigten 25-kDa-Polyethylenimins zur Herstellung eines Low molecular weight Polyethylenimins genutzt. Dieses als F25-LMW-PEI bezeichnete Polyethylenimin zeigte eine verbesserte Transfektionseffizienz sowie eine geringere Zytotoxizität, die bei Transfektionsversuchen mit den Zelllinien SKOV3, U87 und PC3 näher untersucht wurden. Hier konnten bei Co-Transfektionen mit DNA hervorragende Transfektionseigenschaften nachgewiesen werden. Gleichfalls war die durch siRNA vermittelte Herunterregulation der Luciferase bei stabil Luciferase-exprimierenden SKOV3-10-Zellen unter verschiedenen Transfektionsbedingungen eindeutig nachweisbar. Auch nach Lyophilisierung und Resolubilisierung der PEI/siRNA/DNA-Komplexe konnte ein Genknockdown durch RNAi beobachtet werden. Zur weiteren Charakterisierung des F25-LMW-PEI-vermittelten siRNA-Targetings tumorrelevanter Genprodukte wurden die Prostatakarzinomzelllinie PC3 sowie die Glioblastomzelllinie U87 verwendet. Die Prostatakarzinomzellen PC3 exprimieren den wichtigen Angiogenese-Faktor VEGF, welcher vermehrt beim Tumorwachstum und der damit verbundenen Angiogenese nachgewiesen wird. Eine Vielzahl von Krebsarten geht mit einer erhöhten VEGF-mRNA-Expression einher. Die Möglichkeit des wirkungsvollen siRNA-Targetings und des Knockdowns wurde durch ein vermindertes PC3-Zellwachstum im WST-Assay dargestellt. U87-Zellen exprimieren den Heparin-bindenden Wachstumsfaktor Pleiotrophin (PTN), welcher vermehrt bei bösartigen Erkrankungen gefunden wird. Die protoonkogene Wirkung des PTN-Gens beruht hauptsächlich auf der Stimulation der Proliferation von Tumorzellen und der Angiogenese. Bei den U87-Zellen konnte bei den mit der spezifischen PTN-siRNA transfizierten Zellen eine PTN-Herunterregulation auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden, was zu einer verminderten Zellproliferation führte. Die Möglichkeit der Lyophilisierung der F25-LMW-PEI/siRNA-Komplexe war auch bei Transfektion der PC3- sowie der U87-Zellen eindeutig nachweisbar und es zeigten sich nach der Transfektion mit den spezifischen siRNAs ein vermindertes Zellwachstum der malignen Zellen sowie eine verminderte Konzentration von PTN auf Proteinebene.
DOI:http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0456