Interaction dynamics between heterotrimeric G-proteins and type V adenylyl cyclase determine sensitivity of effector regulation

The signalling pathway from G-protein-coupled receptors to the second messenger cAMP is present in virtually all cells and of major physiological and pathophysiological importance. The membrane-spanning receptors can easily be targeted by pharmaceutical compounds and therapies to treat diseases like...

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Main Author: Milde, Markus
Contributors: Bünemann, Moritz (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2013
Pharmakologie und Toxikologie
Subjects:
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Table of Contents: Praktisch alle Zellen des menschlichen Körpers verfügen über den Signalweg vom G-Protein-gekoppelten Rezeptor zum sog. „second messenger“ (zweiter Botenstoff) cAMP. Diese Signalkaskade ist von großer physiologischer und pathophysiologischer Bedeutung. Die in die Zellmembran eingelassenen Rezeptoren sind leicht zugänglich für pharmakologische Wirkstoffe. Daher beeinflussen verschiedene Krankheitstherapien, z.B. die Behandlungen von Bluthochdruck, Asthma und Schmerzen, direkt oder indirekt die zellulären cAMP-Spiegel. Biochemische Studien konnten bereits wichtige Informationen liefern über die Interaktion der an diesem Signalweg beteiligten Proteine. Dazu gehören die Rezeptoren selbst, die G-Proteine und die Adenylylzyklasen. Durch die Entwicklung neuartiger mikroskopischer Methoden konnten diese Interaktionen auch dynamisch untersucht werden. Derartige Techniken wurden bereits vielfach verwendet, um die Dynamik der Rezeptoraktivierung, des G-Proteins und des second messengers cAMP in vivo zu untersuchen. Die Erforschung der Adenylylzyklasen (AC) stützte sich bisher aber hauptsächlich auf in vitro Methoden oder Untersuchungen des Gleichgewichtszustandes der Interaktion der AC mit anderen Proteinen. Während dieser Arbeit wurde, basierend auf dem Förster Resonanzenergietransfer (FRET), eine neue Untersuchungsmethode entwickelt. Mit ihr ist es möglich, die dynamische Interaktion zwischen G-Proteinen und ACs zu erforschen und biochemische Studien in lebenden Zellen durchzuführen. Darüber hinaus wurde ein Protokoll für FRET-Messungen in lebenden Zellen etabliert, mit dessen Hilfe die Regulation von cAMP durch inhibitorische Gi-Proteine verfolgt werden kann. Um diese Versuche zu ermöglichen, wurde eine fluoreszenzmarkierte Typ V AC (AC5) kloniert. Dieses Konstrukt zeigte eine Wildtyp-ähnliche Funktionalität in Biolumineszenz-basierten cAMP-Untersuchungen, in denen Forskolin und stimulatorische G-Protein-Signalwege eingesetzt wurden. Mittels des neu entwickelten Protokolls für FRET-basierte cAMP-Untersuchungen konnte darüber hinaus nachgewiesen werden, dass die markierte AC5 auch durch Gi-Proteine reguliert wird. Auch hier unterschied sie sich nicht von unmarkierter AC5. Der neue Assay wurde verwendet, um die agonistabhängige Interaktion zwischen der AC5 und den verschiedenen G-Proteinuntereinheiten (Gαs, Gαi und Gβ1γ2) zu untersuchen. Nach der Stimulation zugehöriger Rezeptoren wurde für alle Paarungen die Entwicklung eines FRET-Signals beobachtet, obwohl nicht festgestellt werden konnte, dass die Proteine unter nicht-stimulierten Bedingungen miteinander interagieren. Bemerkenswerterweise waren diese Signale für alle Paarungen unterschiedlich ausgeprägt. Der agonistabhängige Anstieg im FRET zwischen Gβ1γ2-Untereinheiten und AC5 folgte einem monoexponentiellem Verlauf, ähnlich dem, der aus anderen G-Protein-Versuchen bekannt war. Der FRET-Anstieg zwischen der Gαs-Untereinheit und AC5 war durch ein Maximum vor dem Signalplateau charakterisiert. Im Gegensatz zu diesen Kurvenverläufen zeigte das FRET-Signal zwischen der Gαi1-Untereinheit und AC5 einen zusätzlichen vorübergehenden Anstieg, sobald der Agonist ausgewaschen wurde. Die verschiedenen Signalformen, die zwischen AC5 und den Gα-Untereinheiten beobachtet wurden, werden vermutlich durch zusätzliche Konformationsänderungen im G-Protein/AC-Komplex hervorgerufen. Für alle untersuchten G-Protein-Untereinheiten konnte festgestellt werden, dass sich die FRET-Signale mit der AC5 schnell entwickelten und im gleichen zeitlichen Rahmen abliefen, wie die schon bekannte Aktivierung der G-Proteine an sich. Die Interaktion zwischen Gαi1-Untereinheit und AC5 stellte sich als besonders sensitiv heraus. Weitere Untersuchungen konnten belegen, dass die Empfindlichkeit dieser Wechselwirkung tatsächlich linksverschoben war gegenüber der Aktivierung des Gi1-Proteins an sich. Diese Verschiebung konnte durch die Untersuchung nachfolgender Signalschritte auch auf funktioneller Ebene bestätigt werden. Hierzu wurde die Gi-Protein-abhängige Inhibierung der AC5 mittels des neu etablierten Protokolls zur FRET-basierten cAMP-Messung durch den Epac1-camps-Sensor gemessen. Im Vergleich zur Aktivität des GIRK-Kanals, der klassischerweise zur Bestimmung der Aktivität des Gi-Proteins verwendet wird, zeigte sich, dass die Rezeptor-abhängige, Gi-Protein-vermittelte Regulation der AC5 um zwei Zehnerpotenzen sensitiver war. Dieses Ergebnis bestätigt frühere Berichte, die ebenfalls eine deutlich höhere Sensitivität von cAMP-Signalwegen, im Vergleich zu Gi-Protein-Aktivitäts-basierten Signalen, gefunden hatten. Durch geeignete Kontrollen konnte ausgeschlossen werden, dass die Verschiebung der Sensitivität durch experimentelle Bedingungen hervorgerufen wurde. Somit blieb die Interaktionskinetik als wichtiger Einfluss übrig. Tatsächlich wurde entdeckt, dass die Interaktion der Gαi1-Untereinheit und AC5 länger andauerte, als durch die Deaktivierung des Gi1-Proteins zu vermuten war. RGS4 konnte diese lange Interaktion auch nicht signifikant verkürzen. Dieses Ergebnis deutet auf eine langsame Dissoziation von Gαi1 und AC5 hin, welche die Deaktivierung des Gi1-Proteins und nachfolgend die Formierung der inaktiven Konformation verzögert. Dadurch wird die Dynamik des G-Protein-Zyklus beeinflusst und vermutlich das Gleichgewicht zwischen inaktiven und aktiven G-Proteinen derart verschoben, dass mehr aktive, AC5-gebundene G-Proteine vorhanden sind. Dieser molekulare Mechanismus könnte die mutmaßliche Erklärung für die beobachtete hohe Sensitivität in den Interaktionsstudien liefern.