RNAi-based anti-cancer strategies - targeting the proto-oncogene PIM1 and oncogenic miRNAs

Cancer is a chronic disease caused by a degeneration of somatic cells due to mutations. In general cells grow erratic and under certain conditions this leads to an infiltration of even healthy tissues. To date cancer is the second most common cause of death in the Western world and belongs to one of...

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Main Author: Thomas, Maren
Contributors: Hartmann, Roland K. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2013
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
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Table of Contents: Krebs ist eine chronische Erkrankung, bei der Körperzellen durch Mutationen entarten, unkontrolliert wachsen und unter bestimmten Voraussetzungen gesundes Gewebe infiltrieren. Heutzutage zählt Krebs als zweithäufigste Todesursache der westlichen Welt zu den wichtigsten epidemiologischen Krankheitsbildern unserer Gesellschaft. Neben klassischen Behandlungsmethoden wie Resektion des Tumorgewebes, Chemo oder auch Immuntherapie ist die Entwicklung neuer Therapieoptionen von großer Bedeutung. Eine mögliche neue therapeutische Alternative ist der Einsatz kleiner, nicht kodierender, regulatorischer RNAs wie z.B. miRNAs. MiRNAs sind an der Regulation wesentlicher biologischer Prozesse wie Entwicklung, Differenzierung oder Proliferation beteiligt, indem sie die Genexpression über den Mechanismus der RNA Interferenz beeinflussen. Seit ihrer Entdeckung bestätigte sich die Annahme, dass miRNAs sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Funktionen ausüben, weshalb sie sich nicht nur als diagnostische oder prognostische Biomarker des Krebsgewebes eignen, sondern auch als Therapeutika selbst eingesetzt werden könnten. In einer miRNA Substitutionstherapie wird der Verlust oder die Herunterregulierung einer miRNA mit tumorsuppressiver Wirkung durch externe Zugabe ausgeglichen. Eine Antisense Therapie vermittelt hingegen eine Inhibition onkogener miRNAs durch komplementäre Oligonukleotide. Eine sichere und effiziente Aufnahme der RNA Moleküle zum Wirkort muss in beiden Ansätzen sichergestellt werden. Zurzeit ist die Entwicklung effizienter Delivery Systeme der limitierende Faktor für miRNA basierte Therapieansätze. In dieser Arbeit wurde zunächst das Proto Onkogen PIM1 bezüglich einer möglichen RNAi basierten Antikrebstherapie untersucht. Eine Überexpression der PIM1 Kinase wird in zahlreichen soliden Tumoren oder malignen Entartungen des hämatopoetischen Systems beobachtet und ist in der Regel mit einem schwerwiegenden Krankheitsverlauf assoziiert. In vitro Studien an humanen Leukämie und Kolonkarzinom Zelllinien konnten erstmalig zeigen, dass die zelluläre PIM1 Proteinexpression durch eine miRNA mit tumorsuppressiver Wirkung, nämlich miR 33a, spezifisch herunterreguliert wird, woraus zusätzlich ein proliferationsinhibierender Effekt resultiert. Ein erfolgreiches Delivery von nanopartikulären Vesikeln aus miR 33a Oligonukleotiden und einem nicht toxischen, verzweigtkettigen Polyethylenimin (PEI F25 LMW) führte in Maus Tumor Modellen zu einem antitumorigenen Effekt, der durch eine Reduktion des Tumorvolumens gezeigt werden konnte. Diese in vitro und in vivo Studien weisen das Proto Onkogen PIM1 erstmalig als erfolgversprechendes Zielobjekt für eine miRNA vermittelte Substitutionstherapie aus. Der Fokus des zweiten Projektes lag auf der Entwicklung neuartiger LNA basierter miRNA Inhibitoren, im Weiteren LNA Antiseeds genannt, bestehend aus einzelsträngigen Oligonukleotiden mit sog. Locked Nucleic Acid (LNA) Modifikationen und einem natürlich vorkommenden Phosphodiester Nukleotidrückgrat. Im Allgemeinen erhöht ein LNA Design sowohl die Resistenz der Oligonukleotide gegenüber einem Abbau durch zelluläre Nukleasen als auch ihre Affinität zur Ziel miRNA, wobei durch komplementäre Bindung an onkogene miRNAs deren zelluläre Funktionen ausgeschaltet werden. Bereits die Verwendung geringer Konzentrationen an LNA Antiseeds zeigte in humanen Krebs Zelllinien eine nahezu vollständige Inhibition onkogener miRNAs der miR 106b Familie, die durch eine Steigerung der endogenen Derepression des Tumorsuppressors P21 gezeigt wurde. Eine erfolgreiche Verpackung der neuartigen LNA basierten miRNA Inhibitoren mit dem verzweigtkettigen Polyethylenimin PEI F25 LMW sowie die funktionelle Aufnahme der gebildeten Nanopartikel in humane Krebszelllinien konnte in weiteren in vitro Experimenten gezeigt werden. Der Einsatz von PEI F25 LMW komplexierten LNA Antiseed miRNA Inhibitoren könnte nun auch in Xenograft Tumor Modellen der Maus als ein erfolgversprechender Ansatz einer Antisense Therapie getestet werden. Im dritten Themenkomplex dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des onkogenen miRNA Clusters miR 17 92 untersucht. Eine Überexpression dieses Clusters ist mit gesteigerter Proliferation, Angiogenese und verminderter Apoptose assoziiert und wird in zahlreichen hämatopoetischen und soliden Tumoren beobachtet. Die Transkription von miR 17 92 wird dabei maßgeblich durch das Onkogen MYC reguliert. In vitro Experimente in humanen Krebs Zelllinien zeigten, dass auch der miR 17 92 Cluster zu jenen 20 % aller MYC regulierten Gene gehört, dessen Transkription durch einen Synergismus zwischen MYC und PIM1 gesteuert wird. Weitere Untersuchungen hinsichtlich der transkriptionellen Regulation von miRNA Promotoren könnten zukünftig dazu beitragen, die Zusammenhänge zwischen miRNA-Expression und der Entstehung von Krebs näher zu charakterisieren.