Untersuchung von Galectin-3 im apikalen Transport der Beta-Untereinheit der H,K-ATPase in MDCK-Zellen

Die Parietalzelle des Magens ist, wie auch andere an die Außenwelt grenzende Zellen, eine polare Epithelzelle. Diese Zellen weisen eine charakteristische Trennung der Membran in eine apikale und eine basolaterale Seite auf, die wichtig für die einzelnen Funktionen des Zelltyps und für die Wirkungsw...

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1. Verfasser: Eilbracht, Mathias
Beteiligte: Jacob, Ralf (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2013
Klinische Zytobiologie und Zytopathologie
Ausgabe:http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0169
Schlagworte:
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topic H,K-ATPase
Transport
H,K-ATPase
apical
Beta-Untereinheit
beta-subunit
Transport
transport
apikal
MDCK-Zelle
Medizin, Gesundheit
Galectin-3
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MDCK-Zelle
Medizin, Gesundheit
Galectin-3
galectin-3
Eilbracht, Mathias
Untersuchung von Galectin-3 im apikalen Transport der Beta-Untereinheit der H,K-ATPase in MDCK-Zellen
Like many other cells at the boundary to environment, the gastric parietal cell is a polar epithelial cell. The membrane of these cells is subdivided into an apical and a basolateral part. Hence, single cells, organs and finally the whole apparatus are able to correctly perform necessary functions. Currently, two different sorting platforms are discussed that direct lipids and proteins to the apical membrane. On the one hand this sorting is mediated by lipid rafts. This mechanism concentrates proteins and lipids in microdomains of the membrane by forming clusters. These clusters are then transported to the apical cell surface. On the other hand there is a raft-independent route mediated by lectins. By cross linking the proteins and forming different clusters, Galectin-3 initializes the transport to the apical surface. The transport route guiding the gastric H,K-ATPase to the apical surface is still unknown. With respect to the transportation, the β-subunit seems to be of crucial relevance. Due to the strong glycosylation of the β-subunit it is the ideal target for lectins like galcetin-3. The scope of this work is to investigate the influence of galectin-3 on the transport of the H,K-ATPase’s β-subunit. Microscopic analysis suggests the coexistence of galectin-3 and the β-subunit in subapical structures. The number of co-localisations decreased with increasing cultivation time. Furthermore, the co-immunoprecipitations do not show an interaction between both proteins. Galectin-3 knockdown using siRNA does not significantly change polarized sorting of the β-subunit either. Only a slightly decreased fraction in the membrane and an increased intracellular fraction are detected. Hence, it is unlikely that Galectin-3 plays an important role in apical sorting of the β-subunit. Furthermore, microscopic analysis indicates the co-localisation of β-subunits with rab11. Rab11 is a marker of recycling endosomes which have noticeable similarities with the tubulovesicular system found in parietal cells. In the same way, a co-localisation of the β-subunit and the lipid raft marker caveolin-1 is detected. Subsequent raft-isolation confirms the microscopic observations. For the first time, the β-subunit is detected in raft-dependent transport routes. However, the direction of transportation and the existence of alternative transport routes call for further research. Summing up, the results presented in this work lead to the conclusion that a governing role of Galectin-3 in the sorting of the gastric H,K-ATPase is very unlikely. The experimental data rather suggest a raft-dependent transport of the β-subunit.
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description Die Parietalzelle des Magens ist, wie auch andere an die Außenwelt grenzende Zellen, eine polare Epithelzelle. Diese Zellen weisen eine charakteristische Trennung der Membran in eine apikale und eine basolaterale Seite auf, die wichtig für die einzelnen Funktionen des Zelltyps und für die Wirkungsweisen ganzer Organe und Organsysteme ist. Zur Zeit geht man für den apikalen Transport von zwei Sortierplattformen aus, durch die Proteine und Lipide zu ihrem Bestimmungsort geleitet werden. Zum einen über lipid rafts, welche Proteine und Lipide in bestimmten Bereichen konzentrieren und zum anderen als eine raft-unabhängige Form, in der durch Quervernetzung mittels Galectin-3 ebenfalls eine Anreicherung und damit Sortierung von Glykoproteinen stattfindet. Für die in Parietalzellen apikal lokalisierte H,K-ATPase ist bisher nicht geklärt, welche dieser Transportplattformen für die korrekte Sortierung verantwortlich ist. Im Zusammenhang mit dem Transport scheint der β-Untereinheit die entscheidende Bedeutung zuzukommen. Da die β-Untereinheit stark glykosyliert ist, war es Ziel dieser Arbeit, herauszufinden, ob das Lektin Galectin-3 eine Rolle in der Sortierung der ATPase spielt. Die mikroskopischen Untersuchungen legen nahe, dass Galectin-3 und die β-Untereinheit zusammen in Kompartimenten der Zelle vorkommen. Die Häufigkeit dieser Kolokalisationen nimmt jedoch mit längerer Kultivierungsdauer ab. In den durchgeführten Koimmunpräzipitationen konnte keine Interaktion der beiden Proteine festgestellt werden. Ein Knockdown von Galectin-3 zeigte keine signifikante Änderung der Lokalisation der β-Untereinheit. Lediglich der Anteil der sich in der basolateralen oder apikalen Membran befindlichen β-Untereinheiten sank leicht und der intrazelluläre Anteil erhöhte sich geringfügig. Diese Ergebnisse machen es unwahrscheinlich, dass Galectin-3 eine entscheidende Rolle in der Sortierung der β-Untereinheit und damit der H,K-ATPase spielt. Es konnte mikroskopisch nachvollzogen werden, dass viele der subapikal gelegenen Strukturen, welche die β-Untereinheit enthielten, Rab11 positiven apikalen Recycling Endosomen entsprachen, die eine Ähnlichkeit mit den in Parietalzellen zu findendem vesikulotubulären System aufweisen. Ebenso konnte die β-Untereinheit in Strukturen nachgewiesen werden, die Caveolin-1, einen lipid raft Marker, enthielten. Die nachfolgende raft-Isolation bestätigte diese visuellen Eindrücke. Es konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass die β-Untereinheit der H,K-ATPase raft-abhängig transportiert wird. Die Richtung des Transportes und alternative Transportrouten werden zukünftig zu erforschen sein. Zusammengefasst machen es die Ergebnisse dieser Dissertation unwahrscheinlich, dass Galectin-3 eine Rolle in der Sortierung der H,K-ATPase spielt. Es konnte stattdessen ein raft-abhängiger Transport der β-Untereinheit nachgewiesen werden.
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contents Like many other cells at the boundary to environment, the gastric parietal cell is a polar epithelial cell. The membrane of these cells is subdivided into an apical and a basolateral part. Hence, single cells, organs and finally the whole apparatus are able to correctly perform necessary functions. Currently, two different sorting platforms are discussed that direct lipids and proteins to the apical membrane. On the one hand this sorting is mediated by lipid rafts. This mechanism concentrates proteins and lipids in microdomains of the membrane by forming clusters. These clusters are then transported to the apical cell surface. On the other hand there is a raft-independent route mediated by lectins. By cross linking the proteins and forming different clusters, Galectin-3 initializes the transport to the apical surface. The transport route guiding the gastric H,K-ATPase to the apical surface is still unknown. With respect to the transportation, the β-subunit seems to be of crucial relevance. Due to the strong glycosylation of the β-subunit it is the ideal target for lectins like galcetin-3. The scope of this work is to investigate the influence of galectin-3 on the transport of the H,K-ATPase’s β-subunit. Microscopic analysis suggests the coexistence of galectin-3 and the β-subunit in subapical structures. The number of co-localisations decreased with increasing cultivation time. Furthermore, the co-immunoprecipitations do not show an interaction between both proteins. Galectin-3 knockdown using siRNA does not significantly change polarized sorting of the β-subunit either. Only a slightly decreased fraction in the membrane and an increased intracellular fraction are detected. Hence, it is unlikely that Galectin-3 plays an important role in apical sorting of the β-subunit. Furthermore, microscopic analysis indicates the co-localisation of β-subunits with rab11. Rab11 is a marker of recycling endosomes which have noticeable similarities with the tubulovesicular system found in parietal cells. In the same way, a co-localisation of the β-subunit and the lipid raft marker caveolin-1 is detected. Subsequent raft-isolation confirms the microscopic observations. For the first time, the β-subunit is detected in raft-dependent transport routes. However, the direction of transportation and the existence of alternative transport routes call for further research. Summing up, the results presented in this work lead to the conclusion that a governing role of Galectin-3 in the sorting of the gastric H,K-ATPase is very unlikely. The experimental data rather suggest a raft-dependent transport of the β-subunit.
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spelling diss/z2013/0169 2013-03-26 2013-03-01 opus:4749 2013-03-26 http://dx.doi.org/10.17192/z2013.0169 The role of Galectin-3 during the apical transport of the H,K-ATPases' beta-Subunit in MDCK-cells 2013 Die Parietalzelle des Magens ist, wie auch andere an die Außenwelt grenzende Zellen, eine polare Epithelzelle. Diese Zellen weisen eine charakteristische Trennung der Membran in eine apikale und eine basolaterale Seite auf, die wichtig für die einzelnen Funktionen des Zelltyps und für die Wirkungsweisen ganzer Organe und Organsysteme ist. Zur Zeit geht man für den apikalen Transport von zwei Sortierplattformen aus, durch die Proteine und Lipide zu ihrem Bestimmungsort geleitet werden. Zum einen über lipid rafts, welche Proteine und Lipide in bestimmten Bereichen konzentrieren und zum anderen als eine raft-unabhängige Form, in der durch Quervernetzung mittels Galectin-3 ebenfalls eine Anreicherung und damit Sortierung von Glykoproteinen stattfindet. Für die in Parietalzellen apikal lokalisierte H,K-ATPase ist bisher nicht geklärt, welche dieser Transportplattformen für die korrekte Sortierung verantwortlich ist. Im Zusammenhang mit dem Transport scheint der β-Untereinheit die entscheidende Bedeutung zuzukommen. Da die β-Untereinheit stark glykosyliert ist, war es Ziel dieser Arbeit, herauszufinden, ob das Lektin Galectin-3 eine Rolle in der Sortierung der ATPase spielt. Die mikroskopischen Untersuchungen legen nahe, dass Galectin-3 und die β-Untereinheit zusammen in Kompartimenten der Zelle vorkommen. Die Häufigkeit dieser Kolokalisationen nimmt jedoch mit längerer Kultivierungsdauer ab. In den durchgeführten Koimmunpräzipitationen konnte keine Interaktion der beiden Proteine festgestellt werden. Ein Knockdown von Galectin-3 zeigte keine signifikante Änderung der Lokalisation der β-Untereinheit. Lediglich der Anteil der sich in der basolateralen oder apikalen Membran befindlichen β-Untereinheiten sank leicht und der intrazelluläre Anteil erhöhte sich geringfügig. Diese Ergebnisse machen es unwahrscheinlich, dass Galectin-3 eine entscheidende Rolle in der Sortierung der β-Untereinheit und damit der H,K-ATPase spielt. Es konnte mikroskopisch nachvollzogen werden, dass viele der subapikal gelegenen Strukturen, welche die β-Untereinheit enthielten, Rab11 positiven apikalen Recycling Endosomen entsprachen, die eine Ähnlichkeit mit den in Parietalzellen zu findendem vesikulotubulären System aufweisen. Ebenso konnte die β-Untereinheit in Strukturen nachgewiesen werden, die Caveolin-1, einen lipid raft Marker, enthielten. Die nachfolgende raft-Isolation bestätigte diese visuellen Eindrücke. Es konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass die β-Untereinheit der H,K-ATPase raft-abhängig transportiert wird. Die Richtung des Transportes und alternative Transportrouten werden zukünftig zu erforschen sein. Zusammengefasst machen es die Ergebnisse dieser Dissertation unwahrscheinlich, dass Galectin-3 eine Rolle in der Sortierung der H,K-ATPase spielt. Es konnte stattdessen ein raft-abhängiger Transport der β-Untereinheit nachgewiesen werden. Untersuchung von Galectin-3 im apikalen Transport der Beta-Untereinheit der H,K-ATPase in MDCK-Zellen urn:nbn:de:hebis:04-z2013-01693 Like many other cells at the boundary to environment, the gastric parietal cell is a polar epithelial cell. The membrane of these cells is subdivided into an apical and a basolateral part. Hence, single cells, organs and finally the whole apparatus are able to correctly perform necessary functions. Currently, two different sorting platforms are discussed that direct lipids and proteins to the apical membrane. On the one hand this sorting is mediated by lipid rafts. This mechanism concentrates proteins and lipids in microdomains of the membrane by forming clusters. These clusters are then transported to the apical cell surface. On the other hand there is a raft-independent route mediated by lectins. By cross linking the proteins and forming different clusters, Galectin-3 initializes the transport to the apical surface. The transport route guiding the gastric H,K-ATPase to the apical surface is still unknown. With respect to the transportation, the β-subunit seems to be of crucial relevance. Due to the strong glycosylation of the β-subunit it is the ideal target for lectins like galcetin-3. The scope of this work is to investigate the influence of galectin-3 on the transport of the H,K-ATPase’s β-subunit. Microscopic analysis suggests the coexistence of galectin-3 and the β-subunit in subapical structures. The number of co-localisations decreased with increasing cultivation time. Furthermore, the co-immunoprecipitations do not show an interaction between both proteins. Galectin-3 knockdown using siRNA does not significantly change polarized sorting of the β-subunit either. Only a slightly decreased fraction in the membrane and an increased intracellular fraction are detected. Hence, it is unlikely that Galectin-3 plays an important role in apical sorting of the β-subunit. Furthermore, microscopic analysis indicates the co-localisation of β-subunits with rab11. Rab11 is a marker of recycling endosomes which have noticeable similarities with the tubulovesicular system found in parietal cells. In the same way, a co-localisation of the β-subunit and the lipid raft marker caveolin-1 is detected. Subsequent raft-isolation confirms the microscopic observations. For the first time, the β-subunit is detected in raft-dependent transport routes. However, the direction of transportation and the existence of alternative transport routes call for further research. Summing up, the results presented in this work lead to the conclusion that a governing role of Galectin-3 in the sorting of the gastric H,K-ATPase is very unlikely. The experimental data rather suggest a raft-dependent transport of the β-subunit. ths Prof. Dr. Jacob Ralf Jacob, Ralf (Prof. Dr.) Philipps-Universität Marburg Eilbracht, Mathias Eilbracht Mathias
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