ATP-dependent chromatin remodelers - Analysis of expression patterns and impact on gene regulation

ATP-abhängige Chromatin Remodeler sind eine Gruppe von Enzymen, welche die Energie aus der ATP-Hydrolyse nutzen, um die Chromatinstruktur zu verändern. Damit spielen sie eine bedeutende Rolle für die Transkriptionskontrolle wichtiger zellulärer Prozesse, wie beispielsweise Proliferation, Seneszenz und Differenzierung. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf CHD5, ein neu identifiziertes Mitglied der ATP-abhängigen Chromatin Remodeler. Um wichtige biologische Funktionen dieses Proteins studieren zu können, wurden polyklonale Peptid-Antiseren, zusammen mit einem später kommerziell erhältlichen Antikörper, für den Gebrauch in Western Blot, Immunpräzipitation und Immunfluoreszenzfärbungen etabliert. ATP-abhängige Chromatin Remodeler zeigen vollkommen unterschiedliche Expressionsmuster. Diese reichen von einer ubiquitären Präsenz bis hin zu einer auf spezielle Zellpopulationen beschränkten Expression. Bislang ging man davon aus, dass CHD5 nur in neuronalen Geweben exprimiert wird. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass dies nicht zutrifft, da das CHD5 Protein in Hoden-Lysaten von Nagetieren detektiert werden konnte. Weiterhin wurden RNA- und Proteinextrakte diverser Zelllinien auf ihre CHD5-Expression hin untersucht. Keine der untersuchten Neuroblastom- und Glioblastom-Zelllinien zeigte eine signifikante CHD5-Expression. Zumindest in den Neuroblastom-Zelllinien steht dies in Einklang mit der vermuteten Rolle als Tumorsuppressor in dieser Tumorentität. Außerdem konnte eine primäre Astrozytenkultur etabliert werden. Proteinlysate dieser Kultur waren negativ in Bezug auf eine CHD5-Expression, jedoch konnte das Protein in Extrakten muriner neuronaler Stammzellen nachgewiesen werden. Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass eine CHD5-Expression im Hirn auf bestimmte Zellpopulationen beschränkt ist, nämlich auf neuronale Stammzellen und vermutlich zusätzlich auf Neurone, jedoch nicht in Astrozyten exprimiert wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der Chromatin Remodeler BRG1 und CHD4 auf die TNFα-vermittelte Induktion von NF-κB Targetgenen untersucht. Die Expression von BRG1 bzw. CHD4 wurde mit Hilfe von spezifischen siRNAs in HEK293 Zellen herunter reguliert. Anschließend wurden die Zellen für ein bis vier Stunden mit TNFα stimuliert. Die Induktion von typischen NF-κB Targetgenen wurde mit Hilfe einer RT-qPCR untersucht. Dabei ergab sich, dass beide Proteine für die Induktion aller untersuchter Targetgene nach einer Stunde benötigt werden. Die Expression der Targetgene nach vier Stunden war nicht beeinträchtigt, ebenso unverändert war die des Haushaltsgens ß-Actin. Dies war überraschend, denn CHD4 ist hauptsächlich als Repressor bekannt. Hier konnte jedoch ein Stellenwert innerhalb der aktiven Transkription gezeigt werden. Um einen Einblick zu erhalten, in welcher Form CHD4 und BRG1 an der untersuchten Targetgen-Induktion beteiligt sind, wurden Ko-Immunpräzipitationen der NF-κB Untereinheit RelA mit CHD4 bzw. BRG1 nach einer Inkubation mit TNFα durchgeführt. Es konnten keine robusten Interaktionen der Proteine gezeigt werden. Weiterhin wurden ChIP-Experimente mit der NF-κB Untereinheit p50, Histon H3 und CHD4 am Beispiel des Targetgens CXCL2 nach einer TNFα-Induktion durchgeführt. Nach einer kurzen Inkubationszeit mit TNFα wurde p50 zum CXCL2-Promoter rekrutiert. Die Dichte von Histone H3 im Bereich des Promoters und, weniger ausgeprägt, auch des Open-Reading-Frame sank ebenfalls innerhalb der ersten Stunde. Dies symbolisiert eine stattgehabte Aktion von Chromatin Remodelern. Eine Rekrutierung von CHD4 blieb jedoch unklar aufgrund technischer Details. Daher bleibt der Mechanismus der beobachteten Effekte während dieser Transkriptionsaktivierung unbekannt. Zusammengefasst wurde eine wichtige aktivierende Funktion der beiden Chromatin Remodeler BRG1 und CHD4 während der frühen Phase der TNFα-Antwort gezeigt.