Synthese und physiologische Funktion der chemischen Chaperone Ectoin und Hydroxyectoin

Eine unter Bakterien weit verbreitete Anpassungsstrategie an hyperosmotische Umgebungsbedingungen ist die Aufnahme oder die Synthese von osmotisch wirksamen Substanzen, die sogenannten kompatiblen Solute. In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Aspekte aus dem Bereich der Synthese von den sogenannten...

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Main Author: Pittelkow, Marco
Contributors: Bremer, Erhard (Prof. Dr. ) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2011
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Eine unter Bakterien weit verbreitete Anpassungsstrategie an hyperosmotische Umgebungsbedingungen ist die Aufnahme oder die Synthese von osmotisch wirksamen Substanzen, die sogenannten kompatiblen Solute. In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Aspekte aus dem Bereich der Synthese von den sogenannten kompatiblen Soluten aufgeklärt. Ein häufig genutztes kompatibles Solut in Bakterien ist das Tetrahydropyrimidinderivat Ectoin. Dieses kompatible Solut kann in einem weiteren enzymatischen Schritt durch eine Ectoin-Hydroxylase EctD zu Hydroxyectoin hydroxyliert werden. Um diese Hydroxylierungsreaktion besser zu verstehen, wurde in dieser Arbeit durch Röntgenstrukturanalysen die Kristallstruktur der Ectoin-Hydroxylase EctD aus V. salexigens in Zusammenarbeit mit der AG von Prof. Dr. K. Reuter (Universität Marburg) aufgeklärt. Die Ergebnisse aus der Kristallstruktur von EctD mit gebundenem Eisen, ein Vergleich des aktiven Zentrums der EctD Struktur mit Ectoin bindenden Substratproteinen aus Ectoin Transportern sowie der bioinformatische Vergleich von putativen EctD Proteinsequenzen führten zu einer Auswahl an Aminosäuren, die für eine Mutagenesestudie herangezogen wurden. Die Ergebnisse der Mutagenesestudie von hoch-konservierten Aminosäuren lieferten wichtige Informationen über deren Funktion und über den möglichen Synthesemechanismus des EctD Enzyms. Da man jedoch keine EctD Struktur mit gebundenem Substrat Ectoin oder Co-Substrat 2-Oxoglutarat erhalten konnte, wurden weitere potentielle Ectoin-Hydroxylasen aus verschiedenen Mikroorganismen kloniert und affinitätschromatographisch gereinigt. Alle gereinigten Ectoin-Hydroxylasen aus den Bakterien Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10, Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi, Acidiphilium cryptum und Halomonas elongata sowie dem Crenarchaeon N. maritimus waren enzymatisch aktiv. Dazu wurden die genauen Essaybedingungen jeder Ectoin-Hydroxylase in Bezug auf pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration angepasst und optimiert. Danach erfolgte die enzymatische Charakterisierung und die Ermittlung der biochemischen Parameter wie Km, vmax und kcat. Durch weitere bioinformatische Analysen der ect Gene, die überwiegend als ein geschlossenes Gencluster in den Organismen organisiert sind, wurden weitere interessante Gene innerhalb des ect-Genclusters identifiziert. Dabei trat immer wieder ein für eine Aspartokinase kodierendes ask Gen auf. Die Aspartokinasen synthetisieren aus L-Aspartat den für die Ectoin Synthese wichtigen Vorläufer β-Aspartat-Semialdehyd im Zusammenschluss mit einem Asd Enzym. Im Genom des Bakteriums Pseudomonas stutzeri A1501 wurden zwei Gene für potentielle Aspartokinasen gefunden. Ein Gen befindet sich im ect-Gencluster und das zweite ask Gen ist an anderer Stelle im Genom lokalisiert. Die beiden Gene der Aspartokinasen wurden kloniert, die Proteine heterolog in E. coli produziert und durch enzymatische Tests charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten wichtige Unterschiede im Hinblick auf die Eigenschaften der beiden studierten Aspartokinasen in diesem Bakterium. In Wachstumsanalysen mit dem Actinomyceten Streptomyces coelicolor A3(2) wurde die physiologische Bedeutung der beiden kompatiblen Solute Ectoin und Hydroxyectoin untersucht. S. coelicolor wird durch Ectoin und Hydroxyectoin unter hohen osmotischen Bedingungen und hohen Temperaturen protektiert. Es konnte gezeigt werden, dass beim Einsatz eines 1:1 Gemischs von Ectoin und Hydroxyectoin diese Protektion am effektivsten ist. Des Weiteren wurde durch Transportstudien mit radioaktiv markiertem [14C]-Ectoin untersucht, bei welcher Salinität und bei welcher Temperatur die Aufnahme der kompatiblen Solute in S. coelicolor induziert wird. Durch die Kombination der beiden Stressfaktoren wie Hochsalz und hohe Temperatur, konnte gezeigt werden, dass in dieser Situation die Aufnahme am stärksten angeschaltet wird.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2012.1048