The role of p53 and CYLD in mitochondrial death pathways and mechanisms of neuronal necroptosis

Der Untergang von funktionsfähigem Hirngewebe durch neuronalen Zelltod stellt eine zentrale Ursache für die klinische Manifestation von Spätschäden nach Schädel-Hirn Trauma und cerebraler Ischämie dar. Auch die Symptomatik fortgeschrittener chronisch neurodegenerativer Erkrankungen, wie der Alzheimer- und Parkinsonerkrankung ist auf den Verlust neuronaler Funktionalität zurückzuführen. Interessanterweise zeigen die zugrundeliegenden zellulären Mechanismen große Gemeinsamkeiten, so dass neuronaler Zelltod in diesen Erkrankungen ungeachtet ihrer grundsätzlich verschiedenen Ursachen und Ausprägungen in der Regel nach Signalwegen der Apoptose, Nekroptose, oder Autophagie erfolgt. Trotz intensiver Forschung ist es bis heute jedoch nicht gelungen das gewachsene Verständnis der molekularen Zusammenhänge in die Entwicklung einer effektiven neuroprotektiven Strategie zu überführen. Ein vielversprechender Ansatz, um diesem Mangel an Therapieoptionen in Zukunft zu begegnen, sieht die Verstärkung endogener Signalwege vor, die das zelluläre Überleben durch Neutralisierung von toxischen Einflüssen sichern. Ein wichtiger Vertreter dieser neuroprotektiven Signalwege ist der NF-κB Transkriptionsfaktor. Eine Steigerung der Transkriptionsaktivität von NF-κB kann durch Hemmung von p53 und CYLD erzielt werden, zwei wichtigen Proteinen, die das zelluläre Überleben nicht nur durch Ihren Einfluss auf NF-κB, sondern auch durch weitere Mechanismen beeinflussen können. Vor diesem Hintergrund war es ein zentrales Ziel dieser Arbeit die Bedeutung von p53 und CYLD im neuronalen Zelltod zu untersuchen und ihre Auswirkung auf den neuronalen NF-κB Signalweg zu analysieren. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurden im Rahmen dieser Arbeit eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) wie auch Kulturen von primären kortikalen Neuronen eingesetzt. Darüber hinaus fand ein in vivo Modell zum Schädel- Hirn Trauma Anwendung, um die gewonnenen Erkenntnisse in einem physiologisch etablierten Tiermodel der akuten Hirnschädigung zu verifizieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass Inhibition von p53 und CYLD neuronalen Zelltod verhindern und mitochondriale Funktionalität erhalten kann.Interessanterweise waren die protektiven Effekte beider Ansätze in HT-22 Zellen unabhängig vom NF-κB Transkriptionsfaktor. Im Einklang mit diesen Ergebnissen stand die Beobachtung, dass Glutamat- induzierter Zelltod in HT-22 Zellen keine detektierbare Veränderung des NF-κB Transkriptionsweges zeigte. In HT-22 Zellen scheint der NF-κB Transkriptionsfaktor daher eine untergeordnete Rolle zu spielen und ist zudem an der Vermittlung der neuroprotektiven Wirkung von p53 Inhibition und CYLD Depletion nicht beteiligt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der schützende Effekt von Pifithrin-α vermittelter p53 Hemmung anteilig auf transkriptionsunabhängigen Effekten am Mitochondrium beruht. Der Mechanismus, der dem neuroprotektiven Effekt der CYLD-Depletion zugrunde liegt, konnte ebenfalls identifiziert werden. Entgegen dem früheren Verständnis haben jüngere Forschungsergebnisse gezeigt, dass Mechanismen des kontrollierten Zelltodes nicht rein apoptotische Vorgänge sein müssen. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen konnte die vorliegende Arbeit das Verständnis über kontrollierte nicht-apoptotische Mechanismen des neuronalen Zelltods erweitern und zeigen, dass in HT-22 Neuronen Glutamat induzierter Zelltod anteilig nach Signalwegen der Nekroptose erfolgt. Die Formierung des Nekrosoms, eines Komplexes aus den beiden RIP-Kinasen RIP1 und RIP3, gilt gemeinhin als zentraler Induktions- und zugleich Exekutionsmechanismus der Nekroptose. Die Bildung dieses Komplexes konnte erstmalig für neuronale Zellen im Glutamat-abhängigem Zelltod nachgewiesen werden. Mit Blick auf den neuroprotektiven Effekt der CYLD Depletion konnte ferner gezeigt werden, dass der Verlust von CYLD die Bildung des Nekrosoms zu unterdrücken vermag. Die herausragende Bedeutung der beiden RIP Kinasen im Glutamat-abhängigen Zelltod in HT-22 Zellen konnte unter Anwendung von siRNA vermittelter selektiver Depletion von RIP1 und RIP3 nachgewiesen werden. Der Verlust von jeweils einer der beiden RIP-Kinasen sowie die Inhibition der Kinase-Funktion von RIP1 durch Necrostatin1 reduzierten signifikant die Glutamat-induzierte Toxizität und den Verlust mitochondrialer Funktionalität. Im exzitotoxischem Zelltod in primären kortikalen Neuronen konnte die vorliegende Arbeit keinen protektiven Effekt durch CYLD Depletion zeigen. Die Hemmung der RIP-1 Kinase durch Necrostatin1 hingegen ermöglichte in Analogie zum Model der HT-22 Zellen eine deutliche Reduktion des neuronalen Zelltodes. Diese Daten deuten auf einen CYLD unabhängigen, aber RIP1 anhängigen Mechanismus hin, der Gegenstand künftiger Forschungsbemühungen sein wird. Im Tiermodel zum Schädel Hirn-Trauma konnte die vorliegende Arbeit das protektive Potential der kontrollierten Hemmung von CYLD jedoch bestätigen und zeigen, dass CYLD defiziente Mäuse ein deutlich reduziertes Infarkt-Volumen und Hirnödem nach Schädel-Hirn Trauma aufweisen. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmalig dargestellt werden, dass neuronaler Zelltod in vitro und in vivo durch Depletion von CYLD hemmbar ist. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass der neuroprotektive Effekt einer Hemmung von p53 anteilig auf mitochondrialen Prozessen beruht. Weitere Forschungsbemühungen sind jedoch erforderlich, um den genauen Mechanismus zu identifizieren, der zu einer Aktivierung der CYLD und RIP- abhängigen Signalwege führt und die Effekte von p53 am Mitochondrium auf molekularer Basis erklärt.