Biodegradable multifunctional nanocarriers for pDNA and siRNA delivery

In this thesis, biodegradable non-viral polymeric nucleic acids delivery vectors were characterized concerning biophysicochemical parameters. In the first part of this research, to answer the questions: why the principle of DNA transfection cannot be directly applied for siRNA transfection, we inv...

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Main Author: Zheng, Mengyao
Contributors: Kissel, Thomas (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2012
Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie
Subjects:
DNA
Online Access:PDF Full Text
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Table of Contents: In der vorliegenden Arbeit wurden neue bioabbaubare Polymere für den Transport von Nukleinsäuren bezüglich ihrer biophysikochemischen Eigenschaften charakterisiert. Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2) untersuchten wir die Komplexierung und den Aggregationsmechanismus von Nukleinsäuren mit Polykationen auf atomarer und molekularer Ebene unter Verwendungen der molekularen Modellierung, molekulardynamischen Simulation, isothermen Titrationskalorimetrie und anderen Charakterisierungsmethoden, um die Frage zu beantworten, warum ein guter pDNA-Vektor nicht unbedingt eben so gut für siRNA funktioniert. Diese Daten zeigten uns sehr unterschiedliche natürliche Eigenschaften und den hierarchischen Mechanismus der Komplexbildung von Polykationen/siRNA und Polykationen/pDNA. Mit der folgenden Untersuchung der Beziehung zwischen dem Nukleinsäuren/Polykationen-Aggregationsmechanismus und der in-vitro-siRNA-Delivery-Effizienz, konnten wir zeigen, dass niedrige N/P-Verhältnisse (Stickstoff/Phosphat) exzellente siRNA-Delivery-Effizienz ermöglichen, dies wurde aber in den bisherigen Untersuchungen für siRNA-Transfektion mit Polykationen vernachlässigt. In Kapitel 3 wurden neue bioabbaubare, amphipathische Copolymere hy-PEI-g-PCL-b-PEG durch die Kupplung von PCL-b-PEG-Ketten auf dem hyper-verzweigten Poly(ethylenimin) als nicht-virale Gentransfer-Vektoren charakterisiert. Der Einfluss der Kupplungsdichten von PCL-b-PEG-Ketten auf physikalisch-chemische Eigenschaften, DNA-Komplexierung und Transfektionseffizienz wurde untersucht und diskutiert. In dieser Studie wurde keine Korrelation zwischen den Größen der Polyplexe und Transfektionseffizienz gezeigt, während sich die Puffer-Kapazität, Zytotoxizität und Zeta-Potential als die entscheidenden Faktoren für Erklärung der Ergebnisse der Gentransfektion erwiesen. Von allen experimentellen Ergebnissen, zeigte die Puffer-Kapazität fast genau die gleiche Tendenz wie die Transfektionseffizienz. Wir gehen daher davon aus, dass in allen Prozessen der DNA-Transfektion, der „endosomal escape“ eine wichtige und geschwindigkeitsbestimmende Rolle spielt. Weitere Untersuchungen dieser biologisch abbaubaren amphipathischen Copolymere hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n als potentiale siRNA-delivery Vektoren wurden in Kapitel 4 berichtet. Der Zweck der Untersuchungne dieses Kapitels war, die in vivo Blutzirkulationszeit und die siRNA Transfektionseffizienz der bioabbaubaren Copolymere hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n zu erhöhen. Unsere Studie zeigte, dass die Wirkung von PEG auf längere Blutzirkulationszeit nicht nur vom prozentualen Inhalt in einem Copolymer abhängt, sondern auch von der Struktur oder Form des Copolymers. Die Polymere-Mizellen, die mit amphipathischen Blockpolymeren entstehen, haben Vorteile für siRNA Transfektion z.B. effektive in vivo siRNA Transfektion und verlängerte Blutzirkulation. Im Kapitel 5, wurde das mit der Folsäure konjugierte Polymer PEI-g-PCL-b-PEG-Fol bezüglich seiner biophysikochemischen Eigenschaften charakterisiert. Geringere Zytotoxizität wurde bei PEI-g-PCL-b-PEG-Fol beobachtet. Die zelluläre Aufnahme wurde durch die Kupplung von Folsäure verbessert. Wichtig ist, dass diese Verbesserung durch freie Folsäure gehemmt wurde, und dass diese Verbesserung auch nicht in Folat-Rezeptor-negativen A549-Zellen beobachtet wurde. Alle Daten bestätigen die Aufnahme der PEI-g-PCL-b-PEG-Fol/pDNA Polyplexe über Folat-Rezeptor-vermittelte Endozytose. Die in vitro DNA Transfektionseffizienz wurde deutlich erhöht durch die Kupplung von Folsäure. Die zusätzlichen Untersuchungen in vivo und Nutzung dieser beschriebenen Folat-konjugierten Copolymeren für gezielte siRNA Transfektion sind in Bearbeitung. In Kapitel 6 wurden hyperflexible Triazin-Dendrimere der Generationen 2-4 als neuartige siRNA-Delivery-Systeme bezüglich ihrer physikalisch-chemischer und biologischer in vitro und in vivo Eigenschaften untersucht und diskutiert. In diesem Kapitel wurden die thermodynamische Eigenschaften durch molekulare Modellierung simuliert, und der Einfluss der Flexibilität wurde systematisch untersucht und diskutiert.