Ion-Channel Engineering: Das monomere Porin OmpG als Modell

Membranproteine wie passive Kanäle und Poren, aktive Transporter und Rezeptoren regulieren den essentiellen Fluss von Informationen und Substanzen über durch Zellmembranen gebildete Permeabilitäts-Barrieren. Aufgrund dieser zentralen Rolle stehen Membranproteine als Angriffspunkt für Wirkstoffe im F...

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Main Author: Große, Wolfgang
Contributors: Essen, Lars-Oliver (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2012
Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Membranproteine wie passive Kanäle und Poren, aktive Transporter und Rezeptoren regulieren den essentiellen Fluss von Informationen und Substanzen über durch Zellmembranen gebildete Permeabilitäts-Barrieren. Aufgrund dieser zentralen Rolle stehen Membranproteine als Angriffspunkt für Wirkstoffe im Fokus des Interesses der pharmazeutischen Industrie. Die Technik des Ion-Channel Engineering (ICE) modifiziert natürliche Kanäle durch chemische und biologische Werkzeuge, um Einblick in die Funktionsweise von Kanälen und Poren zu erhalten. Die erhaltenen Informationen bilden des Weiteren eine Basis für die Verwendung von Ionenkanälen als Bausteine für die Gestaltung komplexer biologischer Systeme, wie sie durch die Synthetische Biologie erforscht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die einzigartigen strukturellen Eigenschaften des monomeren Porins OmpG für die Nutzung als Modellsystem im Feld des ICE untersucht. Das integrale Membranprotein aus der äußeren Membran des Gram-negativen Bakteriums Escherichia coli bildet ein beta-barrel aus 14 beta-Strängen mit einem großen Innendurchmesser von 12 · 15 Å, das als Monomer in Membranen aktiv ist. Das Membranprotein wurde sowohl aus der Membran extrahiert als auch aus Inclusion Bodies mittels rapid dilution rückgefaltet eingesetzt. Zur Funktionalisierung von OmpG wurden zwei Ansätze gewählt, die Funktionalisierung von Cysteinen im zentralen Ionenleitweg des Porins mittels S-Alkylierung und die Funktionalisierung der Pore mittels synthetisierter N-Peptide über Native Chemische Ligation (NCL). Ein zweiter Schritt zur weiteren Modifikation erfolgte durch Cu(I)-katalysierte Click-Chemie. Erzeugte Biohybrid-Poren wurden mit einer Kombination aus SDS-PAGE, Fluoreszenz-Spektroskopie, Massenspektrometrie, Black Lipid Membrane-Messungen (BLM-Messungen) und Proteinkristallisation ausführlich charakterisiert. Beide Modifikationsrouten führten zu funktionellen Biohybriden und die erste Röntgenstruktur eines kovalent funktionalisierten OmpG-Membranproteins wurde erhalten. Die Daten zeigten, dass eine Optimierung der Eigenschaften der Pore für BLM-Messungen und der Aufhängung von Funktionalisierungen im Inneren der Pore notwendig waren. Zur Stabilisierung des Offen-Zustands der Pore wurden zwei verschiedene Deletionen des flexiblen loop6 vorgenommen und charakterisiert. Beide Varianten des Membranproteins waren faltungs-kompetent und zeigten verbesserte Eigenschaften in den BLM-Messungen. Für die Variante des Porins mit der maximalen Verkürzung des loops konnte eine Röntgenstruktur in einer neuen, triklinen Kristallform erhalten werden. Eine Analyse der Kristallpackungen der OmpG-Strukturen ergab zwei hydrophobe Interfaces, von denen mindestens eines in allen verfügbaren Kristallpackungen des Membranproteins OmpG zu beobachten ist. Die Optimierung der Funktionalisierungsaufhängung wurde durch das Einführen einer molekularen Strebe quer durch den Ionenleitweg des Membranproteins durchgeführt. Hierfür wurden zwei Strategien getestet, das direkte Einführen einer Strebe mittels bifunktioneller Verbindungen an Cysteinen und die Verstrebung von zwei unabhängigen Modifikationen initiiert durch Komplexierung eines Metallions. Für den Erfolg letzterer Strategie liegen Indizien durch den Nachweis gebundenen Kupfers mittels ICP-Massenspektrometrie und BLM-Messungen vor. OmpG bietet aufgrund seiner einzigartigen Struktur ein vielversprechendes Templat für das ICE. Das Membranprotein konnte in dieser Arbeit durch Deletion von loop6 für die Anwendung optimiert und verschiedene Strategien zur Erzeugung funktionalisierter Poren konnten erfolgreich etabliert werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2012.0662