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Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Ergotalkaloiden in Pilzen der Familien Trichocomaceae und Arthrodermataceae
Ergotalkaloide (EA) sind eine komplexe Familie von Indolderivaten mit einem tetrazyklischen Ergolinringsystem, die von Pilzen aus zwei unterschiedlichen Familien produziert werden. Dies sind z.B. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) aus der Familie Trichocomaceae oder Claviceps purpurea (C. purpurea...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Ergotalkaloide (EA) sind eine komplexe Familie von Indolderivaten mit einem tetrazyklischen Ergolinringsystem, die von Pilzen aus zwei unterschiedlichen Familien produziert werden. Dies sind z.B. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) aus der Familie Trichocomaceae oder Claviceps purpurea (C. purpurea) aus der Familie Clavicipitaceae. EA besitzen unterschiedliche Strukturen und dadurch auch unterschiedliche biologische Aktivitäten. Aufgrund ihrer Strukturen können EA in drei Gruppen eingeteilt werden: Alkaloide vom Clavin-Typ, Ergoamide und Ergopeptine. Ergoamide sind Amid-Derivate der D-Lysergsäure, während Ergopeptine Peptid-Derivate der D-Lysergsäure darstellen. Alkaloide vom Clavin-Typ enthalten zwar das tetrazyklische Ergolinringsystem, sind jedoch keine Derivate der D-Lysergsäure. Ein Beispiel für diese Gruppe ist Fumigaclavin C, das Endprodukt der Ergotalkaloidbiosynthese in A. fumigatus. Die Pilze der Familie Trichocomaceae produzieren nur Alkaloide vom Clavin-Typ, während Pilze der Familie Clavicipitaceae hauptsächlich Ergoamide und Ergopeptine bilden. Durch den Vergleich der Gencluster für die Biosynthese von EA verschiedener Produzenten konnten sieben homologe Gene identifiziert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Gene in die Bildung des tetrazyklischen Ergolinringsystems involviert sein müssen.
In früheren Studien konnten zwei der sieben homologen Gene, fgaPT2 und fgaMT aus A. fumigatus, den entsprechenden Schritten in der Biosynthese des Ergolinrings zugeordnet werden. Die Prenyltransferase FgaPT2 katalysiert den ersten Schritt, die Prenylierung von L-Tryptophan. Das Produkt 4-Dimethylallyltryptophan wird im nächsten Schritt durch die N-Methyltransferase FgaMT zu N-Methyl-4-Dimethylallyltryptophan umgesetzt.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten die Funktionen von drei weiteren der sieben homologen Gene aus A. fumigatus, fgaDH, fgaOx3 und fgaFS, in der Biosynthese von Fumigaclavin C aufgeklärt werden. FgaDH besitzt die konservierten Motive von klassischen Short-Chain Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs), weist aber ansonsten keine Sequenzähnlichkeiten zu SDRs oder anderen bekannten Proteinen auf. Es konnte gezeigt werden, dass FgaDH die Oxidation von Chanoclavin-I zu Chanoclavin-I-Aldehyd katalysiert, wobei NAD+ als Kofaktor benötigt wird. Die Struktur von Chanoclavin-I-Aldehyd konnte eindeutig durch NMR- und MS-Analysen nachgewiesen werden. Die KM-Werte für Chanoclavin-I und NAD+ betrugen 0,27 bzw. 1,1 mM. Eine Wechselzahl von 0,38 s-1 wurde aus den kinetischen Parametern berechnet.
Das Protein FgaOx3 enthält eine old yellow enzyme-like FMN binding domain, während FgaFS keine konservierten Bereiche oder sonstige Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinen aufweist. Die beiden Proteine FgaOx3 und FgaFS sind zusammen für die Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin verantwortlich. In Abwesenheit von FgaFS kommt es durch FgaOx3 unter Einbau von Sauerstoff zur Bildung eines Produktgemischs, das aus zwei Stereoisomeren besteht und durch FgaFS nicht weiter umgesetzt wird. Die Strukturen von Festuclavin und den zwei Stereoisomeren konnten durch detailierte NMR- und MS-Analysen aufgeklärt werden. Anhand der gesammelten Daten wurde ein Reaktionsmechanismus ausgehend von Chanoclavin-I-Aldehyd postuliert.
Desweiteren konnte in dieser Dissertation durch eine Analyse der Genomsequenzen verschiedener Pilze ein putatives Ergotalkaloidgencluster in den Pilzen der Familie Arthrodermataceae identifiziert werden. Das Cluster besteht aus fünf Genen, deren Homologe in A. fumigatus und C. purpurea in die Bildung von Chanoclavin-I-Aldehyd aus L-Tryptophan involviert sind. Es konnten keine homologen Gene zu denen gefunden werden, die für die weitere Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin bzw. Agroclavin oder für die späteren Schritte im Biosyntheseweg von A. fumigatus bzw. C. purpurea verantwortlich sind.
Aus dem putativen Gencluster von Arthroderma benhamiae (A. benhamiae) wurde das Gen ARB_04646, welches das Homolog zu fgaDH ist, mit korrigierter Intron/Exon-Struktur amplifiziert, kloniert und erfolgreich exprimiert. Das Enzym bekam die Bezeichnung ChaDH. ChaDH katalysiert wie sein Homolog FgaDH in Anwesenheit von NAD+ die Oxidation von Chanoclavin-I. Das enzymatische Produkt konnte durch NMR- und MS-Analysen eindeutig als Chanoclavin-I-Aldehyd identifiziert werden. Die KM-Werte für Chanoclavin-I und NAD+ betrugen 0,09 bzw. 0,36 mM. Aus den kinetischen Parametern wurde eine Wechselzahl von 0,76 s-1 berechnet. In den Kulturüberständen von A. benhamiae konnten keine EA nachgewiesen werden. Die Expressionsanalyse der Gene zeigte, dass unter den gewählten Laborbedingungen keine detektierbare Expression stattfand.
In dieser Arbeit konnte somit eine dritte pilzliche Familie identifiziert werden, die zumindest die genetischen Informationen für die Biosynthese von EA bzw. Chanoclavin-I-Aldehyd enthält. |
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| DOI: | 10.17192/z2012.0490 |