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Cloning of butyrogenic genes from Clostridium difficile and metabolic pathway reconstitution in Escherichia coli
Die vorliegende Arbeit stellt die Entwicklung eines neuartigen Modellsystems dar, welches die Implementierung kompletter Stoffwechselmodule in geeignete Akzeptororganismen zur systematischen Anwendung in der synthetischen Biologie erlaubt. Das bisher wenig untersuchte butyrogene Stoffwechselmodul au...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Englisch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2011
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Die vorliegende Arbeit stellt die Entwicklung eines neuartigen Modellsystems dar, welches die Implementierung kompletter Stoffwechselmodule in geeignete Akzeptororganismen zur systematischen Anwendung in der synthetischen Biologie erlaubt. Das bisher wenig untersuchte butyrogene Stoffwechselmodul aus Clostridium difficile wurde hierzu in Escherichia coli transferiert, bestehend aus den individuellen Enzymen Thiolase (EC 2.3.1.9), -Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157), Crotonase (EC 4.2.1.17), Butyryl-CoA-Dehydrogenase einschließlich der zwei Elektronen transferierenden Flavoprotein-Untereinheiten (EC 1.3.99.2), Phosphotransbutyrylase (EC 2.3.1.19) sowie Butyratkinase (EC 2.7.2.7). Die Enzyme wurden zunächst einzeln in E. coli produziert, funktionell getestet und in vitro charakterisiert. Die dabei erhaltenen kinetischen Parameter sowie Daten zur Substratspezifität und Stabilität gaben Aufschluss über die Fähigkeit der Enzyme zur Produktion von Intermediaten innerhalb von Modulen zur Produktion kurzkettiger Fettsäuren. In diesem Kontext wurden neue Aktivitätstests für Phosphotransbutyrylase und Butyratkinase etabliert. Im Zuge der Entwicklung einer vereinfachten Methode zur Messung der verzweigten Butyryl-CoA-Dehydrogenase in der physiologischen Reaktionsrichtung konnte die Annahme erhärtet werden, das C. difficile entgegen dem intensiv untersuchten C. acetobutylicum mithilfe dieses Enzyms zur Energiekonservierung mit reduziertem Ferredoxin fähig ist. Der potentielle Einfluss derartiger Enzyme bei der Produktion von Butan-1-ol in rekombinanten Stämmen wird in diesem Kontext diskutiert.
Zur Konstruktion des kompletten artifiziellen Stoffwechselmoduls wurden die Gene für oben erwähnte Enzyme erfolgreich zu einem synthetischen Operon assembliert, resultierend in den Expressionsplasmiden pASG.wt_BUTD und pASG.wt_BUTAC, welche sich lediglich in der Herkunft des Butyryl-CoA-Dehydrogenase/ETF-Komplexes unterscheiden. Die Gene für den besagten Komplex stammten entweder aus C. difficile (pASG.wt_BUTD) oder C. acetobutylicum (pASG.wt_BUTAC).
Die rekombinanten Butyrogenen Stoffwechselmodule wurden in vivo untersucht durch Kombinationen aus Enzymtests in zellfreien Extrakten und die Analyse des Fermentationsprozesses im Bezug auf Substrataufnahme, Biomasse-, Produkt- sowie Nebenproduktbildung zum Verständnis des Massenflusses innerhalb des Systems. Tatsächlich waren lediglich die rekombinanten Stämme zur Butyrat-Produktion fähig, mit maximalen Konzentrationen von 3,1 bzw. 3,7 mM im Medium. Während keine großen Unterschiede zwischen den beiden rekombinanten Stämmen bezüglich Wachstum, Substratverbrauch und Produktausbeute beobachtet werden konnten, hatte die Herkunft der jeweiligen Butyryl-CoA-Dehydrogenase dramatische Auswirkungen auf die Kinetik der Produktbildung, eine Beobachtung, die besonders im Bezug auf den potentiellen Einsatz in der biotechnologischen Lösemittelproduktion diskutiert wird. |
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| DOI: | 10.17192/z2011.0604 |