Fragment based Drug Discovery; Design and Validation of a Fragment Library; Computer-based Fragment Screening and Fragment-to-Lead Expansion

In recent years, fragment screening has become a popular approach to identify new lead structures. Fragments are usually defined by the Astex ‘rule of three’ (RO3). Surface Plasmon Resonance (SPR), Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR), biochemical assays and X-ray crystallography are effici...

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Main Author: Craan, Tobias Friedrich
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2011
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
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Table of Contents: In den letzten Jahren wurden vermehrt Fragment-basierte Verfahren verwendet, um neue Leitstrukturen zu identifizieren. Fragmente werden anhand der Astex-Dreier-Regel definiert. SPR, NMR, sowie biochemische Assays und Röntgenstrukturanalyse sind effiziente Verfahren um Fragmente zu entdecken. Diese Methoden müssen auf eine bestehende Fragmentbibliothek angewendet werden. Wir haben unsere eigene Fragmentbibliothek entwickelt. Während des Designs der Fragmentbibliothek haben wir die Astex-Dreier-Regel modifiziert. Es wurde kein strikter physiko-chemischer Filter verwendet. Im letzen Schritt wurden sie visuell inspiziert, was zu einer Bibliothek mit 364 Fragmenten führte. Um die Güte der Bibliothek zu überprüfen, haben wir diese gegen Endothiapepsin getestet. Als Ergebnis erhielten wir 55 aktive Fragmente. Diese wurden kristallographisch untersucht, wobei elf Kristallstrukturen bestimmt werden konnten. Das Programm HotspotsX kann aufgrund von wissensbasierten Potentialen die Aufenthaltswahrscheinlichkeit von einem definierten Atomtyp in einer bestimmten Umgebung der Bindetasche des Zielenzyms vorhersagen. Mit Hilfe der elf Fragmentkristallstrukturen haben wir das Programm HotspotsX validiert. Durch die chemische Diversität und die diversen Posen der Fragmente erhielten wir Hinweise auf aromatische, Donor, Akzeptor, Doneptor und hydrophobe Binder. Die berechneten HotspotsX Karten passen hervorragend zu den experimentell ermittelten Bindungsposen der Fragmente. Das Programm HotspotsX wurde ebenfalls an Kristallstrukturen von Sonden-Molekülen wie Phenol, Harnstoff und Methylharnstoff getestet. Die Bindungsposen dieser Sonden konnten in verschiedenen Zielenzymen mit Hilfe von Röntgenstrukturanalysen ermittelt werden. Die meisten experimentell bestimmten bevorzugten Bindungsregionen passten hervorragend mit den computer-vorhergesagten Positionen überein. Beginnend mit der Sondenstruktur von Phenol in der cAMP abhängigen Protein Kinase A (PKA) haben wir Fragment-basierte Prinzipien angewendet. Sie beruhen auf dem Wachstum von inital entdeckten Fragmenten. In der Kristallstruktur findet man drei Phenolmoleküle, wobei zwei die ATP-Bindestelle besetzen und das andere auf der Glycin-reichen Schleife (G-Schleife) sitzt. Eine computer-basierte Suche wurde durchgeführt. Es wurden Phenol-artige Strukturen vorgeschlagen und für eine konnte eine Kristallstruktur bestimmt werden. Diese Struktur wurde verwendet, um die bevorzugten Bindungsregionen der Bindungstasche auszuleuchten. Das Programm schlug vor, den Liganden in Richtung der G-Schleife zu wachsen, in dieser Region eine aromatische Gruppe zu platzieren und Lys72 mit einer Akzeptorgruppe zu adressieren. Die erste Testverbindung hatte einen Inhibitionswert von 70µM. Im folgenden ersten Design-Zyklus konnte die Affinität auf 6.5µM gesteigert werden. Im zweiten Zyklus wurde eine zusätzliche Aminogruppe an die Leitstruktur synthetisiert, was das Verhältnis Schweratome zu Affinität auf 0.38 anhob. Im letzten Zyklus wurden eine bzw. zwei Methylen-Gruppen als Brücken für die Aminogruppe synthetisiert. Die Affinität für das synthetisierte Diastereomerengemisch zeigte eine Affinität von ca. 110nM. Die Struktur des Phenol-PKA Komplexes zeigte eine mögliche allosterische Bindetasche. Die G-Schleife in diesem Komplex liegt in einer eingeklappten Konformation vor. Diese Konformation könnte durch eines der drei Phenolmoleküle, das auf der G-Schleife sitzt, erzwungen werden. Mehrere Moleküldynamik (MD) Berechnungen wurden durchgeführt, wobei verschiedene Kombinationen bezüglich der Besetzung der drei Phenolmoleküle ausprobiert wurden, um einen Einblick in erste Schritte bei dem Öffnen der Schleife zu bekommen. Die MD Simulation, bei welcher das Phenolmolekül auf der Schleife fehlte, zeigte erste Anzeichen für ein Öffnen der Schleife, was die ersten Schritte eines kaskadenartigen Öffnens darstellen könnte. In einem weiteren Projekt wurde eine virtuelle Suche nach neuen Leitstrukturen der Aldose Reduktase durchgeführt. Von den besten Leitstrukturen wurden fünf Verbindungen synthetisiert und die Affinität gemessen. Unter diesen Leitstrukturen war eine Verbindung, die eine Affinität von 920nM aufwies. Die etablierten Affinitäts-Testsysteme sind, um Fragmente als Binder zu finden, noch nicht ausreichend. Die Herausforderungen liegen in der schwachen Affinität und der schlechten Löslichkeit der Fragmente. Daher wurde der bekannte Temperatur-Stabilitäts-Test auf Fragmente angewendet. Um die Methode zu etablieren, wurden verschiedene Mutanten von EctD charakterisiert. Im letzten Projekt wurden Bindungsposen von Arachidonsäurederivaten in einem K+ Kanal erzeugt, um eine Vorstellung zu bekommen, wie die Bindung aussehen könnte. Eine genaue Bindungspose konnte nicht bestimmt werden, es konnte allerdings gezeigt werden, dass nur ein einzelnes Arachidonsäuremolekül die innere Pore des Kanals blockieren kann.