High-performance liquid chromatography with packed microchips

Die Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss der Packungsporosität zylindrischer Kapillaren und nicht-zylindrischen Kanalgeometrien von Mikrochips auf die Trenneffizienz. Die Reduzierung der Peakdispersion einhergehend mit einer Verbesserung der chromatographischen Trenneffizienz ist das größte Prob...

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1. Verfasser: Ehlert, Steffen
Beteiligte: Tallarek, Ulrich (Prof. Dr. ) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2011
Chemie
Schlagworte:
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss der Packungsporosität zylindrischer Kapillaren und nicht-zylindrischen Kanalgeometrien von Mikrochips auf die Trenneffizienz. Die Reduzierung der Peakdispersion einhergehend mit einer Verbesserung der chromatographischen Trenneffizienz ist das größte Problem was bei Mikro- und Nanotrennsystemen gelöst werden muss, damit alle positiven Einträge die durch die Miniaturisierung erreicht werden auch vollständig ausgenutzt werden können. Hierzu wurden zylindrische Kapillaren mit einem Durchmesser von 30 bis 250 µm mit 5 µm Partikeln gepackt und diese hinsichtlich ihrer Porosität in Abhängigkeit von der Kanalquer-schnittsfläche bei konstantem Partikeldurchmesser untersucht (Kapitel 2). Zusätzlich wurden zwei individuelle Messmethoden evaluiert die erste basierend auf der inversen Grössenausschlusschromatographie und die zweite auf der Donnan-Ausschluss-Chromatographie, die es ermöglichten die Porosität der gepackten Strukturen sicher zu bestimmen (Kapitel 3). Kapitel 4 beschäftigt sich mit der Weiterentwicklung eines HPLC (high performance liquid chromatography) Mikrochips von Agilent Technologies (Waldbronn, Germany). Hierzu wurden systematische Studien der Trenneffizienz in Abhängigkeit von der Porosität der nicht-zylindrichen Kanalgeometrie der Chips erstellt und mittels UV-Detektion vermessen. Dazu wurden verschiedene Packprozesse evaluiert (Variation der Packdrücke und die Implementierung von Ultraschall in den Packprozess) und die sich daraus ergebenden Packungsporositäten und Trennleistungen unter isokratischen Bedingungen untersucht. Die Daten zeigten klar, dass sich mit optimierter Packungsporosität die isokratischen Trennleistungen durch die optimierten Dispersions- und Massentransfer-eigenschaften der gepackten nicht-zylindrischen Trennkanäle deutlich erhöhen ließen. In Kapitel 5 wurden die Ergebnisse der Untersuchungen aus Kapitel 4 auf die kommerziell erhältlichen HPLC/MS-Chips übertragen und unter isokratischen Bedingungen evaluiert und verglichen. Wie nicht anders zu erwarten, konnte eine sehr hohe Übereinstimmung der Trenneffizienzen in Abhängigkeit von der Packungsporosität zwischen den beiden Systemen (HPLC/UV und HPLC/MS-Chips) festgestellt werden. Kapitel 5 und 6 beschäftigen sich mit der Evaluierung der Trenneffizienzsteigerung unter Gradientenelutionsbedingungen. Dafür wurden kleine pharmazeutische Moleküle und etwas komplexere biologische Proben (BSA und Cohn Fraktion IV-4) chromatographisch vermessen. Die Daten zeigten, dass selbst unter der Verwendung von steilen Gradienten sich die Trenneffizienz deutlich erhöhte, einhergehend mit einer gesteigerten Peptididentifikationsrate und Peakkapazität für die untersuchten Analytzusammensetzungen. Dieses liegt begründet in den reduzierten Dispersionseigenschaften der optimiert gepackten Festbetten, die zu deutlich schmäleren Peaks (reduzierte Peakbreiten) führte. Die Arbeit zeigt im Detail in Kapitel 2 (Packing density of slurry-packed capillaries at low aspect ratios) den Einfluss des geometrischen Wandeffektes in polyimid-ummantelte Glaskapillaren (fused silica) in Abhängigkeit vom Partikeldurchmesser (dP) zu Säulenquerschnitt (dC) Verhältnis von 5 < dC/dP < 50. Hierzu wurden die Kapillaren (30 µm -250 µm Durchmesser) mittels einer Suspension aus chromatographischem Packmaterial (5 µm Partikel) gepackt und hinsichtlich ihrer Porosität des generierten Packungsbettes untersucht. Die Bestimmung der Packungsdichten beruhte dabei auf dem Größenausschluss von Polystyrolstandards definierter Masse, die sich im verwendeten Laufmittel Dichlormethan in Abhängigkeit ihrer Molmasse zu definierten Kugeln knäulen und somit vom intrapartikulären Porenraum der Packungsmaterialien sterisch ausgeschlossen werden [1, 2]. Die Elutionszeit der ausgeschlossenen Polystyrole kann somit zur Bestimmung des sogenannten Zwischenkornvolumen oder auch interpartikulären Porosität ( inter) herangezogen werden. Zunächst konnte festgestellt werden, dass die intrapartikuläre Porosität ( intra) der Partikel erwatungsgemäß unabhängig vom dC/dP-Verhältnis ist ( intra ≈ 0,29), da die Porosität der Partikel als unabhängige konstante Größe angenommen werden konnten. Im Gegensatz dazu nahmen die Packungsporositäten von inter ≈ 0,47 bei dC/dP = 5 bis hin zu inter = 0,36-0,37 bei dC/dP = 40-50 ab. Die systematische Zunahme von inter und total (totale Porosität) mit abnehmendem Säulendurchmesser, also mit abnehmendem dC/dP-Verhältnis, ist abhängig vom geometrischen Wandeffekt, der die realisierbaren Porositäten stark beeinflusst. An der starren Wandregion kann nur eine sehr viel höhere Porosität erzielt werden (direkt an der Wand ist die Porosität 1). Die Anordnung der Partikel und die sich daraus ableitende ortsgebundene Porosität verteilt sich statistisch in einer gedämpften Schwingung über einen Bereich von 4-5 Partikeldurchmessern bis hin zu einer zufälligen (random) Anordnung in der Mitte des Kanalquerschnittes, wenn diese Region überhaupt erreicht wird. Es ist daher nicht verwunderlich, dass bei sehr kleinen Kanalquerschnitten und daraus resultierenden geringen dC/dP-Verhältnissen der Einfluss der höheren Porosität in der Wandregion auf die Porosität über gesamten Kanalquerschnitt steigt. Dieses Zusammenspiel zwischen Wand- und Kernregion ist entscheidend für die Homogenität der Verteilung einer Packungsstruktur über den Kanalquerschnitt. Es sollte das dC/dP-Verhältnis entweder so groß gewählt werden, dass der relative Einfluss der Wandregion zurückgedrängt wird, oder so klein das er vorherrschend ist. Es ist daher nicht verwunderlich, das in den Arbeiten von Jorgenson [3, 4] die Trenneffizienz der 5 µm Partikel basierten Packungen bei einer Reduzierung des Kanalquerschnitts von 50 auf 12 µm ansteigt. Bei so kleinen dC/dP-Verhältnissen dominiert die „lose“ gepackte Wandregion, was aber zu einer effektiv höheren Homogenität der Packung führt und somit das dispersive Verhalten der Analyten innerhalb der Packungsstruktur angleicht (homogenisiert). Kapitel 3 (Determination of the interparticle void volume in packed beds via intraparticle Donnan exclusion) stellt einen sehr einfachen und vertrauenswürdigen Alternativansatz zur inversen Größenausschlusschromatographie (ISEC) zur Bestimmung der Packungsporositäten in zylindrischen Kapillaren vor. Basierend auf dem elektrostatischen Ausschluss (Donnan-Ausschluss) eines geladenen (nicht retardierenden) Analyten (Nitrat-Ionen) ist es möglich das interpartikuläre Volumen (Vinter) und somit die interpartikulare Porosität ( inter) zu bestimmen. Dazu wurden Kapillaren mit einem Durchmesser von 75 µm mit verschiedenen Partikelgrößen, Porengrößen und unterschiedlichen Oberflächenmodifikationen in Abhängigkeit der Pufferzusammensetzung (Tris-HCl-Puffer) evaluiert. Die Theorie des elektrostatischen Ausschlusses liefert eine klare und eindeutige Abgrenzung der Grenzflächenphänomene der ladungsselektiven Mesoporen (Porenraum innerhalb der Partikel) und der nicht-ladungsselektiven Makroporen (Porenraum zwischen den Partikeln). Dieser Ansatz erlaubt es den Donnan-Ausschluss geladener Analyten in Abhängigkeit der etablierten elektrischen Doppelschichtüberlappung (EDL overlap) unter den gegebenen physikalischen Bedingungen (Porengröße, Partikeldurchmesser und Pufferstärke) zu etablieren. Die dabei bestimmten Porositäten stimmten sehr gut mit den durch die ISEC-Methode erzielten überein. Die Limitierungen der beiden Methoden (ISEC-und Donnan-Ausschluss) basieren auf denselben Bedingungen. Sind die Partikel zu klein (< 3 µm), kann es zu einem Größenausschluss der Polystyrole vom Außenraum kommen, genau wie es zu einem elektrostatischen Ausschluss der Nitrat-Ionen kommen kann, wenn die Doppelschichtdicken sich zwischen den Partikeln zu überlappen beginnen. Zudem ist es schwierig die Ausschlussbedingungen für sehr große Porengrößen (1000 Å) zu erzielen, da unter diesen Bedingungen die Polystyrole so groß und die Pufferstärken so niedrig gewählt werden müssen, dass es auch zu einem zwischenpartikulären Ausschluss der Analyten kommen kann und somit eine genaue Bestimmung der Porosität nicht ohne weiteres möglich ist. Basierend auf den Untersuchungen die mit Hilfe der zylindrischen Glaskapillaren ausgearbeitet wurden (Kapitel 2 und 3), bestand die Hauptaufgabe der Arbeit darin, den Einfluss der Packungsporosität des HPLC-Chips Systems von Agilent Technologies (Waldbronn, Germany), das eine nicht-zylindrische Kanalgeometrie (trapezförmig) aufwies, in Abhängigkeit des Packprozesses zu untersuchen (Kapitel 4 - Separation Efficiency of Particle-Packed HPLC-Microchips). Simulationen in unserer Gruppe haben deutlich gezeigt, dass die dispersiven Eigenschaften eines Analyten und die daraus resultierenden Trenneffizienzen stark von der Porosität und der Kanalgeometrie abhängen [5]. Diese Arbeiten zeigen, dass mit abnehmender Symmetrie der Kanalquerschnittsfläche (Zylinder Quadrat Rechteck Halbkreis) und hohen Packungsporositäten ( inter = 0,48) der Einfluss der „Ecken“ auf die Homogenität des Flussfeldes der mobilen Phase (und somit auch der sich darin befindlichen Analyten) abnimmt. Dies geht einher mit der Zunahme der Dispersion und einer reduzierten Trenneffizienz. Ist es jedoch möglich, die nicht-zylindrichen Kanalgeometrien effektiv und dicht zu Packen (vor allem die „Ecken“), reduziert sich der zusätzlich dispersive Eintrag dieser, bis hin zu äquivalenten dispersiven Eigenschaften zwischen zylindrischen und nicht-zylindrischen Trennkanälen. Somit ist eine annähernd gleiche Trenneffizienz zwischen den verschiedenen Kanalgeometrien realisierbar, wenn die interpartikuläre Porosität hin zu optimieren Packungsstrukturen reduziert werden kann ( inter ≤ 0,40). Zur Bestimmung der Packungsdichten musste jedoch zuerst ein Prototyp HPLC-Chips Design entwickelt werden, da die zur Bestimmung der Packungsporositäten verwendete ISEC-Methode auf die kommerziell erhältlichen HPLC/MS-Chips nicht anwendbar war (Kapitel 4). Hierzu wurde ein Chip neu erstellt, der eine on-Chip UV Detektion ermöglichte, um die UV-aktiven Polystyrole als auch die zur Trenneffizienz verwendeten Analyten untersuchen und detektieren zu können. Beide Chipsysteme wiesen eine hohe Übereinstimmung im Verhältnis zwischen Trennkanalvolumen zu on-Chip Totvolumen auf (110 für den HPLC/UV Chip und 150 für den HPLC/MS Chip), was einen späteren Vergleich der Trenneffizienzen erst ermöglichte. Im Einzelnen ist in Kapitel 4 beschrieben, dass die Packungsporosität für die HPLC/UV Chips mit zunehmendem Packdruck und der Implementierung von Ultraschall in den Packprozess systematisch reduziert werden kann. Dazu wurden folgende Packzyklen miteinander Verglichen: 150 bar ohne Ultraschall, 150 bar mit Ultraschall, 300 bar ohne Ultraschall und 300 bar mit Ultraschall. In Abhängigkeit der applizierten Packprozesse konnte eine stetige Abnahme der Porositäten von inter = 0,475, inter = 0,46, inter = 0,45, bis hin zu inter = 0,42 beobachtet werden. Die erzielen Porositäten für den Packprozess mit 300 bar und Ultraschall waren vergleichbar zu denen, die mit kommerziell erhältlichen zylindrischen Glaskapillaren mit vergleichbaren Kanalquerschnitt und den gleichen Packungsmaterialen ( inter = 0,42) erhalten wurden. Wie nicht anders zu erwarten, wurden die chromatographischen Trenneffizienzen mit abnehmender Porosität verbessert. Dies zeigte sich in der Darstellung von Bodenhöhenkurven die mit den einzelnen Chips vermessen wurden. Mit abnehmender Porosität reduzierten sich die zusätzlichen dispersiven Einträge innerhalb des Trennkanals und die generierten Packungen waren homogener. Die Mimima der Bodenhöhenkurven wurden zu höheren linearen Geschwindigkeiten verschoben und der Anstieg vor allem im C-Term wurde deutlich reduziert [6]. Dies bedeutet, dass der Massentransferwiderstand deutlich reduziert werden konnte auf Grund der Reduzierung des Einflusses des geometrischen Wandeffektes, einhergehend mit dem Zurückdrängen des dispersiven Eintrages der „Ecken“ durch eine dichtere Packung der nicht-zylindrischen Kanalgeometrie. Für den abschließenden Vergleich der Ergebnisse, die mit den HPLC/UV Chips erzielt werden konnten, wurden die kommerziellen HPLC/MS-Chips mit den gleichen Packprozessen gepackt und hinsichtlich ihrer Trenneigenschaften unter isokratischen und Gradientenelutionsbedingungen evaluiert (Kapitel 5 - Performance of HPLC/MS microchips in isocratic and gradient elution modes). Hierzu wurden basierend auf den Permeabilitätsdaten der HPLC/UV Chips die Porositäten der HPLC/MS Chips abgeschätzt (basierend auf deren Permeabilitäten). Es war festzustellen, dass die HPLC/MS Chips noch einmal eine etwas geringere Porosität innerhalb der Trennkanäle aufwiesen (5 µm Partikel, 150 bar ohne Ultraschall, inter ≈ 0,46; 5 µm Partikel, 300 bar und Ultraschall, inter ≈ 0,41; und für 3.5 µm Partikel 300 bar und Ultraschall, inter ≈ 0,39). Dieses lag darin begründet, dass die Trennkanäle der HPLC/MS Chips mit 43 mm etwas kürzer waren als die der HPLC/UV Chips (73 mm) und somit bei gleichem applizierten Druck während des Packprozesses, sich ein steilerer Druckgradient über die Kanallänge etablierte, der die kürzere Kanalstrecke begünstigte. Es war jedoch festzustellen, dass die HPLC/MS Chips bei niedrigen Retentionsfaktoren (k’) der Analyten trotzdem eine schlechtere Trennleistung aufwiesen. Diese konnte darauf zurückgeführt werden, dass es bei den MS Chips, operativ bedingt (auf Grund der MS-Detektion), zusätzliche externe Volumenbeiträge (externe Banden-verbreiterungsbeiträge) durch die Überführung der ionisierten Analyten in das Massenspektrometer gab. Um diesen absoluten Beitrag zur Bandenverbreiterung zu minimieren, wurden die Analysen bei sehr hohen k’-Werten durchgeführt, da dort der relative Beitrag zur Gesamtdispersion vernachlässigt werden kann [7]. Daher wurde der Vergleich der Trenneffizienzen der beiden Chipsysteme bei k’ = 35 (UV) und k’ = 28 durchgeführt. Der Unterschied in den Retentionsfaktoren, trotz gleicher Laufmittelzusammensetzung (50/50 Acetonitril/Wasser (v/v)), beruhte auf den unterschiedlichen Temperaturen während der Messungen (298 K ± 1 UV; Raumtemperatur und 313 K ± 1 MS; Temperatur im MS-System). Die höheren Temperaturen während der massenspektrometrischen Untersuchungen reduzieren die Viskosität und Dichte des Laufmittels und sorgen zusätzlich für einen erhöhten Massentransfer der Analyten im Trennkanal, was Retentionsverhalten der zu trennenden Substanzen beeinflusst und zu geringeren Retentionsfaktoren führt [7]. Die erzielten reduzierten minimalen Bodenhöhen (hmin) für die optimierten Packungsbetten der HPLC/UV Chips lagen somit bei hmin = 2,5 und für die HPLC/MS Chips bei hmin = 2,1. Diese Werte zeigten deutlich die Konkurrenzfähigkeit der optimierten Packungsstrukturen des HPLC/MS Chipsystems im Vergleich zu anderen kommerziell erhältlichen nano-Säulen. Der Trend der erhöhten Trenneffizienzen in Abhängigkeit der Packungsstruktur wurde dann in der Anwendung mittels kleiner pharmazeutischer und komplexer biologischer Analyten vervollständigt (Kapitel 5 - Performance of HPLC/MS microchips in isocratic and gradient elution modes). Dazu wurden 11 pharmazeutische Analyten mit den HPLC/MS Chips untersucht unter Verwendung verschiedener Gradientensteilheiten. Dabei beschränkte sich die Evaluierung der Effekte auf die Chips gepackt mit 5 µm 150 bar ohne Ultraschall, 5 µm 300 bar mit Ultraschall und 3,5 µm 300 bar und Ultraschall. Hierbei war deutlich festzustellen, relativ unabhängig vom verwendeten Gradienten, dass sich die Peakbreiten um ~ 15% verringerten und die Auflösung der Peaks um ~ 20% erhöht wurde, wenn man die beiden 5 µm Festbetten miteinander verglich. Dieselbe Peakbreitenverbesserung (~ 15%) und Auflösungserhöhung (~ 20%) war festzustellen zwischen den optimierten 5 µm und den optimierten 3,5 µm Packungsstrukturen. Diese Daten korrespondierten in sehr guter Übereinstimmung mit den bereits evaluierten isokratischen Messungen aus Kapitel 4. In Kapitel 6 (Improved particle-packed HPLC/MS microchips for proteomic analysis) wurden abschließend ein tryptischer Verdau des wenig komplexen BSA und der hoch komplexen Cohn4-IV-Fraktion in die Bestimmung der chromatographischen Trenneffizienzen integriert. Hier zeigten sich vier deutliche Trends: 1. Die Reproduzierbarkeit der Messungen gerade bei sehr niedrigen injizierten Konzentrationen verbesserte sich mit zunehmender Packungsqualität, was eine Anwendung der Chips für Langzeitstabilitätsuntersuchungen begünstigt. 2. Es war möglich, die Nachweisgrenze hin zu geringeren Konzentrationen zu verschieben, was eine Anwendung in der Spurenanalytik weiter bevorteilt, und 3. war es möglich, die Identifikationsrate von Peptiden mit der Cohn-Fraktion mit verbesserter Packungsqualität zu erhöhen. So konnten mit der nicht optimierten 5 µm Packung nur 126, mit der optimierten 5 µm Packung 143 und mit der optimierten 3,5 µm sogar 175 Peptide identifiziert werden. Dies bedeutete einen Identifikationsgewinn in einem chromatographischen Lauf von fast 40%. Durch die verbesserten Peakbreiten und Auflösungen war es möglich, mehr diskret von einander getrennte Peaks in das MS zu überführen, was die Ionenverdrängung (ion suppression) herabsetzte. 4. Es konnten auch die Peakkapazitäten mit abnehmender Packungsporosität deutlich erhöht werden. Im Einzelnen konnten Verbesserungen der Peakkapazitäten für den BSA-Verdau von ca. 40% für die optimierten 5 µm (300 bar und Ultraschall) und zwischen 76-94% für die Packungen mit 3,5 µm (300 bar und Ultraschall) erzielt werden im Vergleich mit den 5 µm Packungsstrukturen die mit 150 bar ohne Ultraschall generiert wurden. Diesbezüglich wurden für den Cohn-Verdau eine Erhöhung der Peakkapazitäten von 58% und 94% im Vergleich erreicht. Zusammenfassend kann man sagen, dass es von äußerster Wichtigkeit ist, mikrofluidische Trennsysteme mit einer effizienten und niedrigen Packungsporosität auszustatten. Dazu ist es wichtig, die Packprozesse für die Trennkanäle zu optimieren, was sowohl die Applikation von hohem Druck als auch Ultraschall während der Packungsgenerierung beinhaltet. Nur so ist es möglich, effiziente chromatographische Trennungen durchzuführen und das Potenzial der Miniaturisierung und der damit einhergehenden Minimierung externer Bandenverbreiterungsbeiträge auch wirksam auszunutzen. Diese Verbesserungen führen gerade bei denen in der pharmazeutischen Industrie häufig angewendeten Gradientenelutionen zu einem Identifikationsgewinn vor allem bei komplexen Probenmatrizes, einer verbesserten Langzeitstabilität und zu einer hoch effizienten Trennung von kleinen und komplexen Analysenmolekülen. Es ist möglich auf mikrofluiden Trennsystemen Packungsporositäten zu erreichen die vergleichbar mit denen der weitverbreiteten zylindrischen Kapillaren sind. Grundvoraussetzung hierfür ist jedoch, dass die miniaturisierten Trennsysteme ausreichend druckstabil sind, um den erforderlichen Drücken und der Applikation von Ultraschall während des Packprozesses und den Drücken im Betrieb stand halten zu können. Gerade die Verwendung von Ultraschall ist bei geringen Säulenquerschnittsflächen-zu-Partikeldurchmesser-Verhältnissen essenziell, um eine hohe Packungsdichte und somit eine effiziente Trennung zu erreichen. Das als Basis nehmend, kann der Effekt der Miniaturisierung und Integration der Chromatographie auf ein einzelnes Gerät (miniaturisierte Gesamtanalysensysteme; µTAS) mit allen seinen Vorteilen hinsichtlich der Reduzierung von Analytkonzentrationen, Dispersion und Wegstrecken der Analyten durch das System voll zum tragen kommen und verspricht die best mögliche Trennleistung in der Chromatographie im Nanomaßstab. Literatur [1] Ehlert, S.; Rösler, T.; Tallarek U. J. Sep. Sci. 2008, 31, 1719-1728. [2] Halász, I.; Martin, K. Angew Chem. Int. Ed. 1978, 17, 901-908. [3] Kennedy, R. T.; Jorgenson, J. W. Anal. Chem. 1989, 61, 1128-1135. [4] Hsieh, S.; Jorgenson, J.W. Anal. Chem. 1996, 68, 1212-1217. [5] Khirevich, S.; Höltzel, A.; Hlushkou, D.; Tallarek, U., Anal. Chem. 2007, 79, 9340- 9349. [6] Ehlert, S.; Kraiczek, K.; Mora, J.-A.; Dittmann, M.; Rozing, G. P.; Tallarek, U. Anal. Chem. 2008, 80, 5945-5950. [7] Guiochon, G. J. Chromatogr. A 2006, 1126, 6-49.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2011.0049