Production of glutaconic acid in recombinant Escherichia coli

Glutaric and glutaconic acids serve as monomers for the production of polymers. Glutaric acid (pentanedioic acid) might be used for polyester synthesis, related to the biodegradable Ecoflex available from BASF. Glutaconic acid (pentenedioic acid) could be applied for the formation of polyamides by p...

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Main Author: Djurdjevic, Ivana
Contributors: Buckel, Wolfgang (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2010
Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Glutarsäure (Propan-1,3-dicarbonsäure) und Glutaconsäure (Propen-1,3-dicarbonsäure) dienen als Monomere zur Produktion von Polymeren. Glutarsäure könnte anstelle von Adipinsäure zur Herstellung von Polyestern, wie das biologisch abbaubare Ecoflex, ein Produkt der BASF, verwendet werden. Glutaconsäure könnte mit Diaminen zu Polyamiden kondensiert werden. Zusätzlich ist diese α,β-ungesättigte Säure für radikalische Polymerisationen geeignet. Aus diesen Gründen wollen wir diese interessanten Säuren biologisch produzieren. Das ideale Ausgangsmaterial für die biotechnologische Produktion von Glutaconsäure wäre Glutaminsäure, die leicht aus Zucker hergestellt werden kann. Allerdings ist die α,β-Deaminierung dieser α-Aminosäure chemisch unmöglich. Im Gegensatz dazu fermentieren die strikt anaeroben Darmbakterien Acidaminococcus fermentans und Clostridium symbiosum Glutamat über 2-Oxoglutarat, (R)-2-Hydroxyglutarat, (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA und Glutaconyl-CoA zu Ammonium, CO2, Acetat, Butyrat und H2. Hemmnung der Decarboxylierung von Glutaconyl-CoA zu Crotonyl-CoA würde zu Glutaconat führen. Wir erreichten dieses Ziel auf einem anderen Weg, der Umwandlung von Escherichia coli in einen Glutaconatproduzenten. Dazu exprimierten wir in diesem Bakterium sechs Gene, die folgende Enzyme kodieren: (R)-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase (HgdH), Glutaconat-CoA-Transferase (GctAB) und der extrem sauerstoffempfindliche Aktivator der Dehydratase (HgdC) aus A. fermentans, sowie die ebenfalls sauerstoffempfindliche 2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratase (HgdAB) aus C. symbiosum. So produzierte der rekombinante E. coli Stamm fünf Stunden nach Induktion der Genexpression 2.7 ± 0.2 mM Glutaconat. Das Medium enthielt 1.5% Pepton, 0.3% Hefeextrakt, 100 mM NaCl, 5 mM Glucose, 10 mM Glutamat, 3 mM Cystein, 2 mM Eisen(III)citrat, 0.2 mM Riboflavin und Antibiotika. Interessanterweise sank die Glutamatkonzentration anfangs um 30%, stieg aber später wieder auf den ursprünglichen Wert, während die Glucose fast quantitativ zu zwei Äthanol umgesetzt wurde. Die Reduktion von Glutaconyl-CoA zu Glutaryl-CoA wird von einem Enzym katalysiert, das an der Synthese von Cyclohexancarboxylat und Benzoat in Syntrophus aciditrophicus beteiligt ist. Vorläufige Koexpression der Gene in E. coli, die für Glutaryl-CoA-Dehydrogenase und das Electron-transferring Flavoprotein (EtfAB) von S. aciditrophicus kodieren, bilden ein Enzymsystem, das zusammen mit einer Hydrogenase die Bifurkation von 2 NAD(P)H zu Glutaconyl-CoA und Ferredoxin ermöglicht. Somit entstanden Glutaryl-CoA und H2, obgleich mit einer sehr niedrigen Rate.