On the enzymatic mechanism of 4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase and 4-hydroxybutyrate CoA-transferase from Clostridium aminobutyricum

Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase aus Clostridium aminobutyricum katalysiert die ungewöhnliche reversible Dehydratisierung von 4-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA. Das Enzym ist im nativen Zustand ein Homotetramer mit einer Masse von 232 kDa, und besteht aus zwei katalytisch aktiven Dimeren mit...

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Main Author: Zhang, Jin
Contributors: Buckel, Wolfgang (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2010
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase aus Clostridium aminobutyricum katalysiert die ungewöhnliche reversible Dehydratisierung von 4-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA. Das Enzym ist im nativen Zustand ein Homotetramer mit einer Masse von 232 kDa, und besteht aus zwei katalytisch aktiven Dimeren mit je zwei aktiven Zentren. Darin befinden sich je ein [4Fe-4S]2+ Cluster, ein nicht kovalent gebundenes FAD und einige konservierte Aminosäurereste, deren Oberflächen an einen schmalen Substrat-Bindungskanal grenzen. Die ungewöhnliche Dehydratisierung erfordert die Abstraktion des nicht aktivierten 3Si-Protons (pK ~ 40) vom 4-Hydroxybutyryl-CoA, die das Enzym über eine transiente Deprotonierung und Oxidation zu radikalischen Zwischenstufen bewerkstelligt Das Hauptziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Funktionen hoch konservierter Aminosäuren im aktiven Zentrum. Dabei wurden die Liganden des [4Fe-4S]2+ Clusters, H292C/E, C99A, C103A und C299A, sowie E257Q, E455Q, Y296F, A460G, Q101E, T190V und K300Q durch ortsspezifische Mutagenese verändert. Die sieben erstgenannten Varianten waren enzymatisch völlig inaktiv. Die übrigen zeigten geringe Restaktivitäten (0.4 – 4%). Zusätzlich katalysiert die 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase die Isomerisierung von Vinylacetyl-CoA zu Crotonyl-CoA. Alle Varianten katalysierten diese Reaktion, wobei E455Q (7%), H292E (1%) und C99A (1%) die geringsten Aktivitäten aufwiesen. Überraschenderweise wurden die aktivsten E257Q (92%) und C299A (76%) Varianten durch Luft nicht inaktiviert, während der Wildtyp unter gleichen Bedingungen 90% seiner Aktivität verlor. Die Ergebnisse zeigen, dass wahrscheinlich H292 und E455 sowohl in der Dehydratisierung als auch in der Isomerisierung als katalytische Säure/Basen wirken. Möglicherweise ist E257 an der Stabilisierung des FAD beteiligt und somit für die Isomerisierung ohne Bedeutung. Vor kurzem wurde ein neuer CO2–Fixierungsweg in Archaeen gefunden, der sogenannte 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat Zyklus. In diesem wurde die 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase ebenfalls als ein Schlüsselenzym nachgewiesen. Interessanterweise sind zwei unterschiedene Kopien der 4-Hydroxybutyryl-CoA Dehydratase in Metallosphaera sedula vorhanden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Funktionen dieser beiden Dehydratasen. Die Gene wurden bereits erfolgreich in Plasmide kloniert, aber eine Produktion in Escherichia coli führte nur zu inaktivem Protein. Deshalb ist in Zukunft die Genexpression in Sulfolobus solfataricus geplant, weil sowohl Metallosphaera als auch Sulfolobus zu den thermophilen Crenarchaeota gehören. Die 4-Hydroxybutyrat CoA-Transferase katalysiert die Aktivierung von 4-Hydroxybutyrat zu 4-Hydroxybutyryl-CoA. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit ortsspezifischer Mutagenese herausgefunden, dass E238 während der Katalyse mit CoA ein Thioesterintermediat bildet. Dieses Intermediat wurde auch über den Ping-Pong-Mechanismus, die Reduktion mit NaBH4 und durch thermische Fragmentierung der Peptidkette identifiziert. Die Kristallstruktur mit Butyryl-CoA als Substrat zeigt, dass das aktive Zentrum des homodimeren Enzyms zwischen den beiden Untereinheiten einen schmalen Kanal bildet, an dessen Ende sich E238 befindet. Diese Struktur eines Michaelis Komplexes ist bisher unter den CoA-Transferasen einmalig.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2010.0467