Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF hemmt die Endothelzellapoptose über Regulation von PARP

Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist der stärkste Überlebensfaktor für Endothelzellen. Der anti-apoptotische Effekt von VEGF auf das Endothel ist allgemein bekannt, jedoch sind die Mechanismen, die zu der Apoptosehemmung führen, weitgehend unbekannt. Daher wurde die Hypothese unters...

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1. Verfasser: Hörmann, Mareike
Beteiligte: Al-Fakhri, Nadia (PD Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2010
Medizin
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Apoptosis
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Vascular endothelial Growth Factor
VEGF
Atherosklerosis
Arteriosklerose
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Atherosklerosis
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Hörmann, Mareike
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF hemmt die Endothelzellapoptose über Regulation von PARP
Vascular endothelial growth factor (VEGF) promotes endothelial survival and inhibits atherosclerosis progression. Endothelial apoptosis is potently inhibited by VEGF. Our initial observations showed that longer-term VEGF exposure increased resistance to apoptosis far exceeding the early effect. We hypothesized that VEGF upregulates poly(ADP- ribose)-polymerase-1 (PARP), a caspase target, and sought to determine the impact of PARP regulation on apoptosis in endothelial cells and human arteries. Human endothelial cells (primary, macro-/microvascular lines) incubated with VEGF-A(165) 10-12-10-8M showed a time-dependent increase in apoptosis resistance: Short-term VEGF incubation reduced apoptosis by 65% (p<0.05) induced by the αv-integrin inhibitor cRGDfV. Repeated longer-term incubation reduced apoptosis by more than 90% (p<0.05). VEGF dose-dependently induced PARP protein and mRNA production leading to increased PARP activity in the presence or absence of cRGDfV. FGF-2 or TGFβ had no influence on PARP expression. In mRNA knockdown experiments, the anti-apoptotic effect of VEGF was aborted by PARP siRNA. VEGF signaling leading to increased PARP expression involved VEGF receptor-2, which was colocalized with neuropilin-1, and signal transduction molecules SAPK/JNK and Akt. Immunohistochemistry of human atherosclerotic compared to normal arteries demonstrated increased PARP expression in the endothelium and prominent vascular VEGF expression. In an arterial organ culture model, VEGF induced increased endothelial PARP expression. VEGF exerts a major part of its anti-apoptotic effect on endothelial cells through the regulation of PARP gene expression. PARP counteracts or promotes apoptotic cell death depending on the cellular activation state. In human arteries, VEGF regulation of PARP protects endothelial integrity. Key words: apoptosis, atherosclerosis, cardiovascular diseases, endothelium
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description Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) ist der stärkste Überlebensfaktor für Endothelzellen. Der anti-apoptotische Effekt von VEGF auf das Endothel ist allgemein bekannt, jedoch sind die Mechanismen, die zu der Apoptosehemmung führen, weitgehend unbekannt. Daher wurde die Hypothese untersucht, dass VEGF über die Regulation eines Caspasen-Mediators, wie Poly(ADP-ribose)-Polymerase (PARP), wirkt. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuartiger Wirkmechanismus von VEGF über die Hochregulation des intrazellulären anti-apoptotischen Proteins PARP aufgezeigt. Endothelzellen, HUVEC sowie die Zelllinien EA.hy926 und hCMEC/D3, wurden mit VEGF in unterschiedlichen Konzentrationen (100 pg/ml - 1 µg/ml) inkubiert. VEGF induzierte in Endothelzellen dosisabhängig die Proteinexpression von PARP, wie mittels automatisierter Densitometrie von Western Blots gezeigt wurde. Die mRNA -Produktion von PARP war ebenfalls erhöht, wie in der Real-time RT-PCR demonstriert. VEGF induzierte auch eine erhöhte PARP-Aktivität, wie mithilfe des colorimetrischen PARP-Aktivitätsassays gezeigt. Wiederholte Zugabe von VEGF zu Endothelzellen alle 48 Stunden über eine Inkubationszeit von 6 Tagen führte zu einem stärkeren Anstieg der PARP- Protein- und mRNA-Produktion. Durch durchflusszytometrische Annexin V-FITC / Propidium-Jodid-Messung konnte gezeigt werden, dass VEGF in den untersuchten Konzentrationen die Sensitivität der Endothelzellen für Apoptose, induziert durch Adhäsions-Hemmung mithilfe des αv-Integrinantagonisten cRGDfV, um 60 % bei einmaliger Applikation und um 90 % bei dreimaliger Applikation von VEGF reduzieren konnte, im Vergleich zu Zellen, die nicht mit VEGF vorbehandelt worden waren. Die Induktion von PARP durch VEGF wurde auf der Ebene der Transkription reguliert, gezeigt durch Co-Inkubation mit Actinomycin D, ein potenter Inhibitor der Transkription. Inkubation mit Cycloheximid, einem Translationsinhibitor, hatte keinen Einfluss auf das PARP-Protein. Demzufolge erhöht VEGF die Genexpression von PARP. bFGF oder TGFβ hatten keinen Einfluss auf die PARP-Produktion, der beobachtete Effekt war daher VEGF-spezifisch. Der VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR-2) wurde mittels Immunfluoreszenz auf Endothelzellen nachgewiesen. Ebenfalls konnte der VEGFR-2 Ko-Rezeptor Neuropilin-1 (NP-1) auf Endothelzellen nachgewiesen werden. In die Signaltransduktion von VEGF war VEGFR-2 involviert, wie Ko-Inkubationen mit dem VEGFR-2 Inhibitor SU5416 zeigen konnten. Downstream des Rezeptors wiesen wir die Beteiligung von SAPK/JNK und Akt nach. Um den direkten Zusammenhang zwischen VEGF und der Hochregulation von PARP nachzuweisen, wurden Endothelzellen mit PARP-siRNA behandelt und mit VEGF 100 pg/ml – 1 ng/ml präinkubiert. Transfektion mit PARP-siRNA führt zu einer fast vollständigen Reduktion der Expression von PARP-Protein in Endothelzellen. Mit PARP-siRNA transfizierte Endothelzellen zeigten keine Reduktion der im Durchflusszytometer gemessene Apoptoserate durch Präinkubation mit VEGF im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen, der PARP mRNA-Knockdown konnte also die Apoptosehemmung durch VEGF aufheben. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass VEGF einen Hauptteil seines anti-apoptotischen Effekts auf Endothelzellen über die Regulation der PARP-Expression ausübt. Die Hochregulierung des intrazellulären Proteins PARP durch VEGF könnte einen auto-protektiven Mechanismus der Gefäße zur Neutralisation der pro-apoptotischen Caspasen-Aktivität darstellen, um die endotheliale Empfindlichkeit gegenüber apoptotischen Stimuli zu reduzieren. Dieser Mechanismus könnte Einfluss haben auf die Angiogenese und die Entstehung von Arteriosklerose. Das Verständnis der schützenden Wirkungen von VEGF auf Endothelzellen ist der Schlüssel für die Entwicklung neuer Therapien der Arteriosklerose und anderer mit VEGF assoziierter Erkrankungen.
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contents Vascular endothelial growth factor (VEGF) promotes endothelial survival and inhibits atherosclerosis progression. Endothelial apoptosis is potently inhibited by VEGF. Our initial observations showed that longer-term VEGF exposure increased resistance to apoptosis far exceeding the early effect. We hypothesized that VEGF upregulates poly(ADP- ribose)-polymerase-1 (PARP), a caspase target, and sought to determine the impact of PARP regulation on apoptosis in endothelial cells and human arteries. Human endothelial cells (primary, macro-/microvascular lines) incubated with VEGF-A(165) 10-12-10-8M showed a time-dependent increase in apoptosis resistance: Short-term VEGF incubation reduced apoptosis by 65% (p<0.05) induced by the αv-integrin inhibitor cRGDfV. Repeated longer-term incubation reduced apoptosis by more than 90% (p<0.05). VEGF dose-dependently induced PARP protein and mRNA production leading to increased PARP activity in the presence or absence of cRGDfV. FGF-2 or TGFβ had no influence on PARP expression. In mRNA knockdown experiments, the anti-apoptotic effect of VEGF was aborted by PARP siRNA. VEGF signaling leading to increased PARP expression involved VEGF receptor-2, which was colocalized with neuropilin-1, and signal transduction molecules SAPK/JNK and Akt. Immunohistochemistry of human atherosclerotic compared to normal arteries demonstrated increased PARP expression in the endothelium and prominent vascular VEGF expression. In an arterial organ culture model, VEGF induced increased endothelial PARP expression. VEGF exerts a major part of its anti-apoptotic effect on endothelial cells through the regulation of PARP gene expression. PARP counteracts or promotes apoptotic cell death depending on the cellular activation state. In human arteries, VEGF regulation of PARP protects endothelial integrity. Key words: apoptosis, atherosclerosis, cardiovascular diseases, endothelium
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spelling diss/z2010/0255 2010 2011-08-10 urn:nbn:de:hebis:04-z2010-02553 Vascular endothelial growth factor promotes endothelial survival by induction of poly(ADP-ribose)-polymerase expression in the human vasculature Liu B, Fang M, Lu Y, Mills GB, Fan Z. Involvement of JNK-mediated pathway in EGF-mediated protection against paclitaxel-induced apoptosis in SiHa human cervical cancer cells. Br J Cancer 2001; 85: 303-311 2001 Involvement of JNK-mediated pathway in EGF-mediated protection against paclitaxel-induced apoptosis in SiHa human cervical cancer cells Haunstetter A, Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease. Circ Res 1998; 82: 1111-1129 1998 Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease Mallat Z, Benamer H, Hugel B, Benessiano J, Steg PG, Freyssinet JM, Tedgui A. Elevated levels of shed membrane microparticles with procoagulant potential in the peripheral circulating blood of patients with acute coronary syndrome. 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VEGF induzierte in Endothelzellen dosisabhängig die Proteinexpression von PARP, wie mittels automatisierter Densitometrie von Western Blots gezeigt wurde. Die mRNA -Produktion von PARP war ebenfalls erhöht, wie in der Real-time RT-PCR demonstriert. VEGF induzierte auch eine erhöhte PARP-Aktivität, wie mithilfe des colorimetrischen PARP-Aktivitätsassays gezeigt. Wiederholte Zugabe von VEGF zu Endothelzellen alle 48 Stunden über eine Inkubationszeit von 6 Tagen führte zu einem stärkeren Anstieg der PARP- Protein- und mRNA-Produktion. Durch durchflusszytometrische Annexin V-FITC / Propidium-Jodid-Messung konnte gezeigt werden, dass VEGF in den untersuchten Konzentrationen die Sensitivität der Endothelzellen für Apoptose, induziert durch Adhäsions-Hemmung mithilfe des αv-Integrinantagonisten cRGDfV, um 60 % bei einmaliger Applikation und um 90 % bei dreimaliger Applikation von VEGF reduzieren konnte, im Vergleich zu Zellen, die nicht mit VEGF vorbehandelt worden waren. Die Induktion von PARP durch VEGF wurde auf der Ebene der Transkription reguliert, gezeigt durch Co-Inkubation mit Actinomycin D, ein potenter Inhibitor der Transkription. Inkubation mit Cycloheximid, einem Translationsinhibitor, hatte keinen Einfluss auf das PARP-Protein. Demzufolge erhöht VEGF die Genexpression von PARP. bFGF oder TGFβ hatten keinen Einfluss auf die PARP-Produktion, der beobachtete Effekt war daher VEGF-spezifisch. Der VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR-2) wurde mittels Immunfluoreszenz auf Endothelzellen nachgewiesen. Ebenfalls konnte der VEGFR-2 Ko-Rezeptor Neuropilin-1 (NP-1) auf Endothelzellen nachgewiesen werden. In die Signaltransduktion von VEGF war VEGFR-2 involviert, wie Ko-Inkubationen mit dem VEGFR-2 Inhibitor SU5416 zeigen konnten. Downstream des Rezeptors wiesen wir die Beteiligung von SAPK/JNK und Akt nach. Um den direkten Zusammenhang zwischen VEGF und der Hochregulation von PARP nachzuweisen, wurden Endothelzellen mit PARP-siRNA behandelt und mit VEGF 100 pg/ml – 1 ng/ml präinkubiert. Transfektion mit PARP-siRNA führt zu einer fast vollständigen Reduktion der Expression von PARP-Protein in Endothelzellen. Mit PARP-siRNA transfizierte Endothelzellen zeigten keine Reduktion der im Durchflusszytometer gemessene Apoptoserate durch Präinkubation mit VEGF im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen, der PARP mRNA-Knockdown konnte also die Apoptosehemmung durch VEGF aufheben. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass VEGF einen Hauptteil seines anti-apoptotischen Effekts auf Endothelzellen über die Regulation der PARP-Expression ausübt. Die Hochregulierung des intrazellulären Proteins PARP durch VEGF könnte einen auto-protektiven Mechanismus der Gefäße zur Neutralisation der pro-apoptotischen Caspasen-Aktivität darstellen, um die endotheliale Empfindlichkeit gegenüber apoptotischen Stimuli zu reduzieren. Dieser Mechanismus könnte Einfluss haben auf die Angiogenese und die Entstehung von Arteriosklerose. Das Verständnis der schützenden Wirkungen von VEGF auf Endothelzellen ist der Schlüssel für die Entwicklung neuer Therapien der Arteriosklerose und anderer mit VEGF assoziierter Erkrankungen. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF hemmt die Endothelzellapoptose über Regulation von PARP Vascular endothelial growth factor (VEGF) promotes endothelial survival and inhibits atherosclerosis progression. Endothelial apoptosis is potently inhibited by VEGF. Our initial observations showed that longer-term VEGF exposure increased resistance to apoptosis far exceeding the early effect. We hypothesized that VEGF upregulates poly(ADP- ribose)-polymerase-1 (PARP), a caspase target, and sought to determine the impact of PARP regulation on apoptosis in endothelial cells and human arteries. Human endothelial cells (primary, macro-/microvascular lines) incubated with VEGF-A(165) 10-12-10-8M showed a time-dependent increase in apoptosis resistance: Short-term VEGF incubation reduced apoptosis by 65% (p<0.05) induced by the αv-integrin inhibitor cRGDfV. Repeated longer-term incubation reduced apoptosis by more than 90% (p<0.05). VEGF dose-dependently induced PARP protein and mRNA production leading to increased PARP activity in the presence or absence of cRGDfV. FGF-2 or TGFβ had no influence on PARP expression. In mRNA knockdown experiments, the anti-apoptotic effect of VEGF was aborted by PARP siRNA. VEGF signaling leading to increased PARP expression involved VEGF receptor-2, which was colocalized with neuropilin-1, and signal transduction molecules SAPK/JNK and Akt. Immunohistochemistry of human atherosclerotic compared to normal arteries demonstrated increased PARP expression in the endothelium and prominent vascular VEGF expression. In an arterial organ culture model, VEGF induced increased endothelial PARP expression. VEGF exerts a major part of its anti-apoptotic effect on endothelial cells through the regulation of PARP gene expression. PARP counteracts or promotes apoptotic cell death depending on the cellular activation state. In human arteries, VEGF regulation of PARP protects endothelial integrity. Key words: apoptosis, atherosclerosis, cardiovascular diseases, endothelium 2010-04-27 Hörmann, Mareike Hörmann Mareike ths PD Dr. Al-Fakhri Nadia Al-Fakhri, Nadia (PD Dr.) Philipps-Universität Marburg
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