Entwicklung eines amperometrischen Biosensors für Cyanid

Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines amperometrischen Biosensors für Cyanid unter Ausnutzung einer dreistufigen Reaktionskaskade mit Beteiligung von zwei Enzymen. In der ersten Stufe dieser Kaskade wird Cyanid bzw. dessen korrespondierende Säure Blausäure von Cyanidase (EC 3.5.5.1) zu Ammon...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Ketterer, Lothar Rudolf
Beteiligte: Keusgen, Michael (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2010
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Beschreibung
Zusammenfassung:Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines amperometrischen Biosensors für Cyanid unter Ausnutzung einer dreistufigen Reaktionskaskade mit Beteiligung von zwei Enzymen. In der ersten Stufe dieser Kaskade wird Cyanid bzw. dessen korrespondierende Säure Blausäure von Cyanidase (EC 3.5.5.1) zu Ammoniak und Ameisensäure umgesetzt. Formiat als korrespondierende Base der Ameisensäure wird anschließend von Formiatdehydrogenase (EC 1.2.1.2) zu Kohlendioxid oxidiert, wobei NAD als Cosubstrat zu NADH reduziert wird. Auf der dritten Stufe reagiert die oxidierte Form eines Redoxmediators mit NADH und wird unter Regeneration von NAD in die reduzierte Form überführt. Amperometrisch quantifizierbar sind Formiat auf der ersten, NADH auf der zweiten sowie die reduzierte Form des Mediators auf der dritten Stufe. Technisch kamen zwei verschiedene Sensoraufbauten zum Einsatz. Zum einen wurde ein Durchflusssystem benutzt, das aus einem Injektionsventil, Enzymkartuschen und einer Durchflusszelle für amperometrische Elektrodenchips bestand. Zum anderen wurden Messungen in der Gasphase durchgeführt, wobei ein Elektrodenchip mit einer Mischung aus den für die Kaskade benötigten Enzymen und Reagenzien bedeckt und im Gasraum eines abgeschlossenen Gefäßes platziert wurde. Am Boden des Gefäßes befand sich eine Säurekomponente, die nach Zugabe von Proben darin enthaltenes Cyanid protonierte. In der Folge trat Blausäure in den Gasraum über und gelangte zur Mischung auf dem Elektrodenchip. Formiat aus der ersten Stufe der Kaskade konnte nur durch Platin-Arbeitselektroden detektiert werden. Im Durchflusssystem war eine Kartusche mit immobilisierter Cyanidase jedoch nicht in der Lage, das gesamte Cyanid umzusetzen. Das restliche Cyanid interferierte mit der Platin-Elektrode und störte so die Messung. Ein Abfangen des nicht hydrolysierten Cyanids durch Bildung von Metallkomplexen war nicht erfolgreich. Für die Bestimmung von Cyanid durch Detektion von NADH über ein Durchflusssystem wurde eine Nachweisgrenze von 0,7 µM und eine Bestimmungsgrenze von 2,4 µM ermittelt. Der lineare Bereich erstreckte sich von der Bestimmungsgrenze bis zu 1 mM. Nitrile sowie Sulfid störten die Messung nicht, Thiocyanat interferierte leicht. Es kann allerdings davon ausgegangen werden, dass Formiat im Vergleich zu Cyanid überproportional hohe Signale hervorruft. Messungen von Realproben mit komplexen Matrices wie Pflanzenextrakten waren möglich. Die Richtigkeit der ermittelten Cyanidkonzentrationen in Extrakten von Kirschlorbeerblättern wurde mit der DIN-Methode 38405-13 überprüft, wobei mit einer mittleren Abweichung von -4,8% eine gute Übereinstimmung gefunden wurde. Weiterhin wurde eine gute Langzeitstabilität des Aufbaus festgestellt. Nach mehr als drei Monaten konnte noch kein Abfall der Sensitivität beobachtet werden. Messungen im Gasraum erwiesen sich dagegen als problembehaftet. Zugaben von cyanidfreien Flüssigkeiten in die Säurekomponente verursachten Signale, die in vielen Fällen die gleiche Höhe wie Signale cyanidhaltiger Proben erreichten. Ein starker Einfluss des Wasserdampfdrucks auf das Signal wird vermutet. Lediglich bei Einsatz des Mediators Meldolablau zusammen mit Graphit-Arbeitselektroden, also unter Ausnutzung der vollständigen, dreistufigen Kaskade, konnten cyanidfreie von cyanidhaltigen Proben im millimolaren Konzentrationsbereich unterschieden werden. Die dabei im Gasraum vorhandenen Blausäuremengen bewegten sich zwischen 2 und 800 ppm. Weitere untersuchte Mediatoren wie Kaliumhexacyanidoferrat und Benzochinonderivate erwiesen sich als weitgehend ungeeignet. Die Signalhöhen waren jedoch auch mit Meldolablau als Mediator nur schwer reproduzierbar. Zudem verschlechterte sich das Ansprechverhalten des Sensors mit fortschreitender Messdauer. Die Orientierung des Elektrodenchips im Gasraum nahm ebenfalls Einfluss auf den Signalverlauf. Versuche, die Mischung auf dem Elektrodenchip zu fixieren, verliefen unbefriedigend. Ebenso zeigten chemische und elektrochemische Modifikationen der Arbeitselektrode wenig Erfolg. Hier bedarf es weiterer Entwicklungsarbeit, um einen praktikablen amperometrischen Gassensor nach dem vorgestellten Messprinzip zu erhalten. Die dreistufige Reaktionskaskade scheint jedoch grundsätzlich geeignet für Messungen im Gasraum.