Studien zur Konversion photochemischer und funktioneller Eigenschaften verschiedener Blaulichtrezeptoren

In BLUF-Domänen enthaltenden Proteinen und DNA-Photolyasen wechselwirkt das nichtkovalent gebundene FAD mit Blaulicht und initiiert eine lichtabhängige Signalkaskade bzw. DNA-Reparatur. In beiden Blaulichtrezeptorklassen wurden verschiedene subtypenspezifische funktionelle Eigenschaften beobachtet....

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Main Author: Schroeder, Claudia
Contributors: Essen, Lars Oliver (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:In BLUF-Domänen enthaltenden Proteinen und DNA-Photolyasen wechselwirkt das nichtkovalent gebundene FAD mit Blaulicht und initiiert eine lichtabhängige Signalkaskade bzw. DNA-Reparatur. In beiden Blaulichtrezeptorklassen wurden verschiedene subtypenspezifische funktionelle Eigenschaften beobachtet. Ein Teil dieser Arbeit war die Konversion der E. coli YcgF-(1-137) BLUF-Domäne, welche den Subtyp II repräsentiert, in den Subtyp I (z.B. SyPixD). Zu diesem Zweck wurden verschiedene Oberflächenmutanten zweier in der E. coli YcgF-(1-137) BLUF-Domäne nicht konservierter Aminosäuren (Met 23 und Ala 90) biophysikalisch charakterisiert. Hierbei konnte eine erfolgreiche Konversion des Subtyp II in den BLUF-Domänen Subtyp I anhand veränderter photochemischer Eigenschaften dokumentiert werden. Diese photochemischen Veränderungen zeigten, dass die nativen Aminosäuren Met 23, sowie Ala 90 für einen Großteil der spezifischen Charakteristika der E. coli YcgF BLUF-Domäne verantwortlich sind. Zu diesen veränderten Charakteristika gehören blauverschobene Absorptionsmaxima des Signalzustandes, eine beschleunigte Licht-Dunkel-Konversion, die Flavintriplettzustände und die lichtinduzierte Konformationsänderung des eingefügten Trp 90. Zusätzlich konnte unter Generierung einer Y7F-Oberflächenmutante gezeigt werden, dass dieser in allen BLUF Photorezeptoren konservierte Tyrosinrest auch im E. coli YcgF essentiell für die Schaltung der BLUF-Domäne ist. Aufgrund der fehlenden lichtinduzierten Rotverschiebung und der langlebigen Existenz einer radikalischen Flavinspezies wurde die Y7F-Mutante als Intermediat des BLUF-Photozyklus präsentiert, welches zwischen dem Grundzustand und der Ausbildung des Radikalpaars gefangen ist. Auf Grundlage dieser und zuvor bestimmter Resultate konnte ein möglicher blaulichtinduzierter E. coli YcgF BLUF-Domänen Photozyklus und Signalübertragungsweg vorgestellt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die A. thaliana (6-4)-Photolyase in den Subtyp der CPDPhotolyasen umzuwandeln. Hierfür wurden Oberflächenmutanten hergestellt, die anstelle der nativen für die Bindung des (6-4)-Schadens benötigten Aminosäuren in ihrer katalytischen Bindungstasche spezifische für die Bindung und Reparatur von CPD-Schäden benötigte Aminosäurereste enthalten. Für alle aufgereinigten A. thaliana (6-4)-Photolyasemutanten wurde analog zum Wildtyp der katalytisch aktive, vollständig reduzierte FADH--Zustand generiert und im Fall der K246R, H364N_L365R und W408Y Varianten eine leicht erhöhte Bindungsaffinität zum CPD-Schaden festgestellt. Weiter konnte gezeigt werden, dass die durch Mutagenese eingefügten Veränderungen nicht ausreichen, um die für die CPDReparaturaktivität im A. thaliana (6-4)-Enzym benötigten Interaktionen zu gewährleisten d. h. die (6-4)-Photolyase in den CPD-Subtyp zu konvertieren, im Gegensatz zum YcgF BLUF-Blaulichtrezeptor. Als Ursache dieser Beobachtung wurde ein unterschiedliches Bindungsverhalten beider DNA-Photolyasesubtypen dokumentiert. Hierbei wurden distinkte Unterschiede in der Art des Flippmechanismus im Verlauf der DNA-Bindung, den Deformierungsgrad der geschädigten DNA betreffend, sowie in der Orientierung der gebundenen doppelsträngigen DNA aufgezeigt. Im letzten Teilprojekt wurde die (6-4)-Photolyase aus dem halophilen Eukaryoten D. salina untersucht. Diese Photolyase weist in vitro einen sehr stabilen neutralen semichinoiden FADZustand auf, der möglicherweise einen Signalzustand ähnlich dem pflanzlicher und tierischer Cryptochrome darstellt. Im Verlauf der Photoaktivierung wurden strukturelle Veränderungen der C-terminalen a-helikalen Extension der D. salina Enzym beobachtet, die eventuell für die Interaktion zwischen dem halbreduzierten Enzym und einem Signalpartner essentiell sind. Anhand dieser Resultate wurde für die D. salina (6-4)-Photolyase neben ihrer Photolyaseaktivität eine zusätzliche Cryptochromaktivität prognostiziert, ähnlich dem A. nidulans Cryptochrom A, sowie ein möglicher Mechanismus des Blaulichtrezeptors vorgestellt, der beide Funktionalitäten kombiniert. Demnach präsentiert das D. salina (6-4)-Enzym möglicherweise einen weiteren Schnittpunkt zwischen Photolyasen und Cryptochromen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2010.0145